载多柔比星聚肽自组装体的构建及其体外抗肿瘤研究

发布时间：2017-03-23 14:02

  本文关键词：载多柔比星聚肽自组装体的构建及其体外抗肿瘤研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：癌症与心血管疾病和糖尿病并称严重危害人类健康的三大杀手。单独使用化疗药物或与手术或放疗联用,目前依旧是临床上肿瘤常规疗法。但是,化疗药物应用于临床面临诸多困难与挑战,例如溶解度低,在肝脏中快速降解或在肾脏中快速排泄,在肿瘤部位达不到有效治疗血药浓度导致生物利用度低；药物缺乏选择性和使用各种赋形剂和溶剂引起严重的毒副反应,在一定程度上制约了化疗药物的在临床上应用。解决方案之一即将药物做成纳米制剂。纳米制剂具备较好的物理化学性能和体内缓控释特性；避免药物在体内循环降解失活；通过实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)达到被动靶向作用等优点。自组装嵌段在众多药用材料中作为药物传递系统越来越引起研究者的兴趣。一般而言,两亲性聚肽由亲水性聚乙二醇嵌段(PEG)和疏水聚氨基酸(PAA)嵌段构成,在水溶液可自发聚集。聚合作用合成的聚肽与天然蛋白质具有相似的化学性质,具备良好的生物相容性和生物可降解性。疏水性药物可以通过物理包埋在疏水内核中或者通过化学键与嵌段络合形成载药纳米制剂。除此之外,研究者发现,带有电荷的一些化合物(DNA、质粒、顺铂)可以荷相反电荷的两亲性聚肽通过静电作用络合,自组装形成核-壳式纳米结构。基于以上研究,我们实验室研究了一种新型的阴离子两亲性聚肽聚乙二醇-聚谷氨酸mPEG-PGA为纳米载体,mPEG-PGA是一种人工全合成的、生物可降解、生物相容性良好的两亲性聚肽。此外,聚谷氨酸作为阴离子聚合物其侧链含有含有游离的羧基。可以通过静电作用或者螯合作用与荷正电的药物聚合。因此,为荷正电的抗癌药物提出了一种理想的载药策略,载药过程简单,避免了有机试剂的引入,确保病人用药安全。盐酸多柔比星属于蒽环类抗生素细胞毒药物,可用来治疗多种癌症。但是,严重的心脏毒性、骨髓抑制、肾毒性和多药耐药严重的限制了盐酸多柔比星在临床上的应用。盐酸多柔比星为两亲性弱碱(pKa=8.3),既可以以质子化形式存在也可以去质子化形式存在,调节外环境pH值,盐酸多柔比星亲疏水性变化且带有不同电荷。因此,本课题提出一种基于静电作用的药物传递系统,由荷负电的两亲性聚肽mPEG-PGA和荷正电的盐酸多柔比星为研究对象。两亲性聚肽mPEG-PGA通过开环聚合反应由实验室自主合成,其中,mPEG可延长药物体内循环时间,PGA侧链游离羧基显负电,通过正负电荷相互吸附,荷正电药物DOX·HCl与mPEG-PGA生成高分子离子交联聚合物mPEG-PGA-DOX,通过静电作用和疏水间分子作用力在水溶液自发聚集形成长约300nm左右,Zeta电势为-15.9 mV的纳米棒,载药纳米棒具备较高的载药量(50.8%)和包封率(90.2%)；体外释放实验表明,与盐酸多柔比星原料药相比,载药纳米棒释放缓慢并且具备pH敏感性,载药纳米棒在酸性环境下释放较快；人乳腺癌细胞MCF-7和人肺癌细胞A549体外细胞毒性实验表明,载药纳米棒抗肿瘤活性优于原料药；细胞摄取实验表明载药纳米棒均可以被MCF-7和A549细胞摄取入胞,尤其在A549细胞系中,载药纳米棒更易被A549肿瘤细胞摄取入胞；溶血实验表明人工合成的两亲性聚肽具备良好的生物相容性,并且离子交联后载药纳米棒mPEG-PGA-DOX可以显著降低原料药的溶血性；以wistar大鼠为模型,体内药动学实验表明载药纳米棒呈现良好的药物缓释特征。以上实验表明离子交联后载药纳米棒mPEG-PGA-DOX在抗癌药物传递体系领域具有巨大的应用潜力。
【关键词】：聚乙二醇-聚谷氨酸 盐酸多柔比星 纳米棒 静电作用 肿瘤治疗
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 中文摘要14-16
• 英文摘要16-19
• 符号说明19-22
• 绪论22-32
• 癌症22-23
• 药物传递体系23-30
• 脂质体24-25
• 两亲性聚合物25-27
• 两亲性聚肽27-30
• 本课题设计思路30-32
• 第一章 mPEG-PGA两亲聚肽的合成、表征及聚集行为研究32-44
• 1. 实验材料与仪器32-33
• 1.1 实验材料32
• 1.2 仪器32-33
• 2. 实验方法33-35
• 2.1 两亲性聚肽mPEG-PGA制备33-35
• 2.1.1 端氨基聚乙二醇单甲醚mPEG-NH_2制备33-34
• 2.1.2 聚乙二醇单甲醚-聚谷氨酸mPEG-PGA的制备34-35
• 2.2 分析检测35
• 2.2.1 ~1H-NMR测定35
• 2.2.2 FT-IR测定35
• 2.3 mPEG-PGA聚集行为的研究35
• 2.3.1 芘分子荧光探针法35
• 2.3.2 透射电镜法35
• 2.3.3 动态光散射法35
• 3. 结果与讨论35-43
• 3.1 两亲性聚肽mPEGP-PGA合成36
• 3.1.1 mPEG-NH_2的合成36
• 3.1.2 开环聚合反应36
• 3.2 产物结构确认36-40
• 3.2.1 ~1H-NMR36-39
• 3.2.2 FT-IR测定39-40
• 3.3 mPEG-PGA聚集行为的测定40-43
• 3.3.1 芘分子荧光探针法测定CAC40-41
• 3.3.2 聚集形貌41-42
• 3.3.3 粒径和Zeta电势42-43
• 4. 本章小结43-44
• 第二章 载药聚合物的制备及作为药物递送载体的评价44-62
• 1. 实验材料与仪器44
• 1.1 实验材料44
• 1.2 仪器44
• 2. 载药聚合物的制备和表征44-45
• 2.1 载药聚合物制备44-45
• 2.2 载药聚合物聚集形态表征45
• 2.2.1 TEM观察形态45
• 2.2.2 粒径和电势45
• 2.2.3 CD谱观察二级构象45
• 3 载药量、包封率测定45-49
• 3.1 盐酸多柔比星含量测定方法的建立45-49
• 3.1.1 储备液配置45-46
• 3.1.2 检测波长选择46
• 3.1.3 标准曲线的绘制46-47
• 3.1.4 精密度试验47-48
• 3.1.5 回收率试验48-49
• 3.2 载药量、包封率计算49
• 4. 盐酸多柔比星体外释放行为的测定49-53
• 4.1 盐酸多柔比星含量测定方法的建立49-52
• 4.1.1 色谱条件50
• 4.1.2 专属性试验50-51
• 4.1.3 标准曲线的绘制51-52
• 4.1.4 精密度试验52
• 4.1.5 回收率试验52
• 4.2 盐酸多柔比星体外释放行为的测定52-53
• 5. 结果与讨论53-61
• 5.1 载药聚合物的制备53-54
• 5.2 载药聚合物水溶液聚集行为的研究54-57
• 5.3 载药量包封率57-58
• 5.4 盐酸多柔比星体外释放行为58-61
• 6. 本章小结61-62
• 第三章 载盐酸多柔比星的聚合物纳米棒体外抗肿瘤评价62-77
• 1. 实验材料与仪器62
• 1.1 实验材料62
• 1.2 仪器62
• 2. 实验方法62-66
• 2.1 细胞培养62-64
• 2.1.1 准备工作62
• 2.1.2 细胞复苏62-63
• 2.1.3 传代与换液63
• 2.1.4 计数与接种63-64
• 2.1.5 细胞冻存64
• 2.2 细胞毒实验64-65
• 2.2.1 mPEG-PGA材料的细胞毒性64-65
• 2.2.2 载药纳米棒的抗肿瘤活性65
• 2.3 细胞摄取实验65-66
• 2.3.1 荧光显微镜法65
• 2.3.2 流式细胞术65-66
• 3. 结果与讨论66-75
• 3.1 细胞毒性实验66-68
• 3.1.1 mPEG-PGA对MCF-7细胞毒实验66-67
• 3.1.2 mPEG-PGA对A549细胞毒实验67-68
• 3.2 抗肿瘤活性实验68-73
• 3.2.1 载药纳米棒对MCF-7抗肿瘤活性68-70
• 3.2.2 载药纳米棒对A549抗肿瘤活性70-73
• 3.3 细胞摄取实验73-75
• 3.3.1 荧光显微镜技术73-74
• 3.3.2 流式细胞术74-75
• 4. 本章小结75-77
• 第四章 载药纳米棒体内药动学评价77-88
• 1. 实验材料和仪器77
• 1.1 实验材料77
• 1.2 仪器77
• 1.3 动物77
• 2. 实验方法77-83
• 2.1 溶血试验77-78
• 2.1.1 2%红细胞混悬液(v/v)制备77-78
• 2.1.2 溶血率测定78
• 2.2 血浆盐酸多柔比星含量测定方法78-83
• 2.2.1 色谱条件78-79
• 2.2.2 血浆样品预处理79
• 2.2.3 专属性考察79
• 2.2.4 标准曲线的绘制79-81
• 2.2.5 精密度试验81
• 2.2.6 回收率实验81-83
• 2.3 载盐酸多柔比星纳米棒体内药动学评价83
• 2.3.1 实验方法83
• 2.3.2 血浆浓度测定83
• 2.3.3 药动学参数的计算83
• 3. 结果与讨论83-86
• 3.1 溶血实验83-84
• 3.2 血药浓度测定84-85
• 3.3 药动学参数拟合85-86
• 4. 本章小结86-88
• 全文结论88-90
• 参考文献90-98
• 致谢98-99
• 攻读学位期间发表的学术论文目录99-100
• 代表性SCI论文100-104
• 附件104

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