十氯酮对秀丽隐杆线虫的雄性生殖毒性作用及机制

发布时间：2020-04-26 12:33

【摘要】：研究背景十氯酮(CLD)又名开蓬,是一种人工合成的有机氯农药,由于其存在多种毒性效应,现已被国际社会禁止生产和使用。作为自然界中常见的持久性有机污染物(POPs)之一,十氯酮对环境和人类健康都造成了深远的影响。近年来调查发现我国十氯酮污染情况逐年加重,但国内尚未系统的开展其毒性作用的研究,因此对十氯酮毒效应的研究刻不容缓。研究目的本研究以秀丽隐杆线虫为模型,分别从个体、组织、细胞和分子水平探讨十氯酮对线虫雄性生殖系统的毒作用效应及其诱发生殖毒性的作用机制。研究方法在观察个体水平野生型线虫后代数目、世代时间和雄虫杂交后代数目等指标,评价十氯酮对线虫生育力影响的基础上,通过体视显微镜观察性腺面积、荧光显微镜下观察JK2868突变体性腺远端顶细胞(DTC)发育,DAPI荧光染色测定有丝分裂区、减数分裂区生殖细胞及精细胞数目,微分干涉差显微镜(DIC)下测定精子畸形率,精子活化率等指标探究十氯酮产生雄性生殖毒性作用的靶器官及对精细胞发育过程中的作用靶点。在分子水平上通过实时荧光定量PCR技术测定十氯酮暴露后调控精子活化关键步骤精子主要蛋白(MSP)聚合过程的CEP-8通路基因及调控DNA损伤诱导生殖细胞周期停滞相关基因表达水平变化情况。通过CM-H2DCFDA探针检测线虫体内活性氧自由基(ROS)水平,抗氧化酶试剂盒检测过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性判断十氯酮对线虫氧化应激的影响,RT-q PCR技术测定相关基因gas-1,mev-1,isp-1,sod-1,sod-2,ctl-1的表达水平,并利用自由基清除剂甘露醇探讨对十氯酮造成的生殖毒性保护作用。研究结果十氯酮暴露后,在个体水平上野生型线虫各剂量组后代数目降低,世代时间中高剂量组有所延长;杂交实验结果显示,与空白对照组相比,各暴露组后代数目均有所减少。组织和细胞水平上发现十氯酮暴露造成线虫性腺面积减少,低剂量组面积与对照组相比约减少20%,中高剂量组与空白对照组比较面积减少了约40%;各暴露组的DTC细胞荧光强度与空白对照组比较也有所降低;有丝分裂区生殖细胞数、减数分裂区生殖细胞数和精细胞数均减少并且下降趋势与后代数目相同;精子畸形率升高,活化率下降。分子水平上在对十氯酮生殖毒作用机制研究中发现调控MSP相关基因spe-8,spe-12,spe-19和spe-29表达水平下调,spe-6表达上调,spe-27与对照组相比无明显变化。DNA损伤试验中暴露组荧光点状聚合表达细胞数量上升,且相关基因cep-1、hus-1和clk-2基因表达上调。在进一步对线虫氧化应激情况研究中发现十氯酮暴露后,中高剂量组ROS水平升高;SOD活性在低浓度组中略有上升,在中高浓度组中下降;CAT含量降低;氧化应激相关基因gas-1与mev-1基因在低浓度下表达无差异,中高浓度组下调;isp-1表达上调;sod-1和sod-2基因在低浓度下表达量略有上升,在高浓度组中下降;ctl-1基因表达下调。自由基清除剂甘露醇处理后发现5m M和20m M浓度的甘露醇有效降低了十氯酮暴露后线虫体内的ROS水平,且20m M的甘露醇将线虫体内ROS水平恢复至与空白对照组同一水平。当十氯酮与甘露醇联合暴露后,有丝分裂区生殖细胞数有所恢复,但与空白对照组相比仍有差异。结论十氯酮可通过调控线虫氧化应激相关基因,引起线虫体内氧化损伤,对性腺结构发育产生影响,同时激活CEP-1通路造成生殖细胞DNA损伤,导致生殖细胞周期停滞,精细胞数目减少,可影响精子发生;自由基清除剂甘露醇可在一定程度上缓解十氯酮的生殖毒作用。十氯酮可抑制SPE-8通路,引起MSP聚合异常,干扰精子正常活化,形成畸形、无运动能力精子,造成精子数量减少,形态异常,导致雄性生殖功能障碍。
【图文】：

十氯酮,灭蚁灵,分子结构式

酮与灭蚁灵分子结构见图 1），已有研究表明在使用过灭蚁灵的地区检测到十酮存在[17]。灭蚁灵的使用是造成我国环境中十氯酮污染的主要原因。一般工生产的灭蚁灵中十氯酮浓度为 2.58 mg/kg。相较于灭蚁灵，十氯酮性质更不易变，到目前为止自然环境中未有其次级产物被检测到[18]。我国虽然未有十氯的生产和使用记录，但直到十氯酮被列入全球禁用名单为止，在我国东部地区有大量灭蚁灵被使用[19]。最新监测显示，我国东部沿海地区十氯酮检出率较，锦州湾的 15 个检测位点全部检测有十氯酮残留，残留范围为 0.34～.69ug/kg，平均残留量为 2.43ug/kg，某些高浓度地区已接近甚至超过国际限定 10ug/kg[20]。因为我国并不是十氯酮的直接生产与使用国，所以国内对十氯酮染情况及毒性作用研究较少。但随着灭蚁灵的降解作用，近年来调查发现我国氯酮污染状况愈发严重，对其毒效应研究迫在眉睫。因此，为了更好履行我国为斯德哥尔摩公约缔结国的责任，更好的保护环境和人群健康，，我国应积极开十氯酮污染情况调查，探究十氯酮对人体造成毒性作用的机制。

秀丽隐杆线虫,生长周期

线虫生殖细胞位置相对固定，有利于研究生殖细胞发生过程，并多种生殖功能潜在靶点。同时线虫有雌雄同体、雄性、雌性三种性别，相乳动物在进行交配实验，研究精子发生、交配行为、生育力等毒作用方面优势。此外，线虫的全基因组测序已经完成，线虫生殖系统的功能与机制相当丰富，有利于进行相应的作用机制研究。线虫体内约 40%的蛋白编码人类同源[37]，因此线虫毒作用分子机制的研究对哺乳动物及人的毒理学子通路和特异性应答基因方面具有提示作用[38]。同时线虫中对精子发生及交配行为评价的指标也较为丰富。线虫通体透明，可以应用荧光显微技观察线虫的生殖系统发育情况和生殖细胞的发生过程。加之线虫培养周期所需设备低廉、成本低、适于大规模推广，并且对实验室人员无害等优势 3R 原则。因此，利用秀丽线虫研究十氯酮对雄性生殖系统的毒理学作用毒理学评价早期的初步筛选，以及在特定机制研究等方面具有较大优势，强的可行性。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R994.3

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