以DHCR24为靶点的新型降胆固醇药物的筛选及药效的初步研究

发布时间：2020-04-27 13:32

【摘要】：人体内胆固醇含量过高会引起许多疾病,尤其是心血管疾病。胆固醇主要由内源性合成而来,占总体的80%。内源性合成的最后一步反应为链甾醇还原为胆固醇,催化此反应的酶为DHCR24(3β-脱氢胆固醇-Δ24还原酶)。DHCR24基因的突变(单点突变E191K、N294T、K306N、Y471S和两点突变N294T/K306N)会导致酶活性降低,从而使细胞胆固醇的含量下降。本实验研究以DHCR24蛋白为靶点,以期寻找到通过抑制DHCR24酶活性从而降低细胞胆固醇的新型降胆固醇药物。传统的药物筛选研发成本高并且周期很长,本研究利用计算机虚拟筛选联合细胞平台筛选技术,以达到节约时间和成本,并且提高筛选阳性率的目的。此外,本研究选用现有药物小分子数据库,可以提高候选药物的安全性,进一步为研发药物节约时间与成本,提高筛选效率。本实验首先通过同源建模和分子动力学技术建立、优化并确定DHCR24蛋白结构模型。然后利用分子对接及虚拟筛选技术,在DrugBank数据库中进行初步筛选,得到可能能够竞争性抑制DHCR24与底物desmosterol结合的小分子药物,选取其中打分最优的50个现有药物小分子候选药物。接下来对这50个候选药物进行AutoDock 4精确对接,并进行聚类分析。然后根据其易获得性进行进一步筛选,最终确定了4个候选药物(OND1,OND2,OND3,OND4)。我们利用人肝癌细胞株HepG2细胞培养平台联合高效液相色谱法(HPLC),验证筛选出的4种药物抑制DHCR24酶活性从而降低细胞胆固醇含量的效果。实验结果证明,这四种药物组以及一组阳性对照组U18666A(已知的DHCR24抑制剂)在给定剂量下都能显著降低细胞胆固醇的含量,初步证明了虚拟筛选结果的准确性。接下来,我们利用固醇荧光染色法(非律平)再次验证四种小分子药物的降胆固醇效果。结果显示四种药物降胆固醇的效果均非常显著。最后,我们利用分子动力学模拟的方法,对四种候选药物抑制DHCR24酶活性的具体机制进行了初步研究。综上,本研究发现了四种新型DHCR24抑制剂,并经过初步的细胞水平实验,证明其有降低细胞胆固醇的效果,为将其进一步开发为以DHCR24为靶点的新型降胆固醇药物奠定了坚实的基础。本研究的完成为以DHCR24为靶点开发新型降胆固醇药物提供了新的思路。
【图文】：

内源性,胆固醇,不良反应

2图 0-1 胆固醇内源性合成途径0.1.3 降胆固醇药物的研发现状传统的内源性降胆固醇药物，其种类主要为他汀类药物，作用机理主要是通过抑制胆固醇生物合成过程初始阶段的酶——HMG-CoA 来实现。药效方面主要可以降低 TC 和 LDL-C 水平，提高 HDL-C 水平。然而他汀类药物的副作用很大，长期服用会导致横纹肌溶解[4]，肠胃不适，高血压，高血糖以及肝酶升高等症状[5-6]。其他降胆固醇的药物有：1.贝特类（如苯扎贝特，非诺贝特等），长期服用也会导致皮疹，肠道功能紊乱和胆结石等不良反应；2.烟酸类其不良反应相对轻微。

三维结构模型,构象,活性中心

图 1-1 预测并优化的 DHCR24 三维结构模型.2 对接结果及结合口袋的确定desmosterol 与 DHCR24_FAD 复合物的最优结合构象的 AutoDock vina（binding energy）为-8.4 Kcal/mol。以此构象为基础，利用 AutoDock该结构进行再次精确对接（5000 次对接），将对接后各个结合构象的进行综合分析，可以选定其中能量最低簇并且其构象最为集中的红色图 1-3 A）。选择其中形成一个氢键的第一个构象，确定其为最佳构象活性中心（DHCR24 结合底物 desmosterol 的疏水口袋），从而为后续选确定了活性中心范围。根据以上对接结果，，并经过反复验证，最终性口袋的设置条件。以 desmosterol 与 DHCR24_FAD 复合物结合口袋）为活性中心：中心坐标 x=72.193，y=51.112，z=24.362；网格大小 8×步长（spacing）设置为 1。
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R972.6

【参考文献】