炎症微环境调控性多肽纳米药物的构建及其防治炎症性肠病的作用与机制研究

发布时间：2020-04-27 13:36

【摘要】：炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是累及胃肠道的一组慢性炎症疾病,包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。其易复发、迁延不愈,还可能向结肠癌转变。目前发病机制未完全阐明,用于临床治疗的药物主要包括非甾体抗炎药、糖皮质激素、抗肿瘤坏死因子和抗粘附疗法等,但在使用过程中由于其药物特性和非特异性分布可能导致各种副作用。因此,开发特异、有效和安全的IBD治疗药物具有重要临床意义。在IBD的发生发展过程中,炎症分子、免疫细胞和微生物群落共同形成了肠道促炎性微环境,从而引起IBD。我们推测将IBD的异常炎症微环境恢复正常可能是一种有效治疗IBD的新策略。最新研究证实,炎症的消退是由抑炎分子介导的主动过程,它们能够抑制炎性细胞因子的表达、促进凋亡的细胞和微生物的清除。膜联蛋白A1(Annexin A1)是一种内源性的钙依赖性磷脂结合蛋白,参与抗炎反应、细胞的增殖、分化、死亡信号调控。Ac2-26是Annexin A1 N-末端衍生肽,具有整个蛋白的药理活性。该肽可以抑制炎症反应的各个方面,减少中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞的浸润。炎症性肠病的病理过程伴随着大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成,进而导致氧化应激失衡和机体损伤。本课题期望通过构建活性氧响应性纳米载体包载内源性抗炎多肽Ac2-26来达到改善肠道炎症微环境,治疗炎症性肠病的目的。为了验证该假设,通过在β-环糊精(β-CD)的骨架上共价连接苯硼酸频哪醇酯,成功合成了具有ROS清除和响应特性的新型可降解纳米材料(OxbCD),并包载抗炎多肽Ac2-26制备形成纳米粒(Ac2-26/OxbCD NP,AON)。考察了AON在各种急、慢性结肠炎中的疗效,并对其作用机制进行深入研究。方法1.载Ac2-26抗炎多肽纳米药物的制备与表征4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯(PBAP)作为活性氧响应性基团,将PBAP与β-CD键合,得到ROS响应性载体材料OxbCD。通过核磁共振氢谱(~1H NMR)和红外光谱(FT-IR)来确定OxbCD的结构。以DSPE-PEG、卵磷脂溶于水相,Ac2-26、OxbCD溶于甲醇作为油相,采用纳米沉淀法构建Ac2-26/OxbCD纳米粒(AON)。采用相同的方法构建空白纳米载体(ON)和包载Ac2-26的PLGA纳米粒(APN)。采用透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)观察形态,激光粒度仪(DLS)测定粒径和Zeta电位。通过荧光分光光度计测定AON的包封率和载药量。2.AON的活性氧响应性水解、体外释放和稳定性测定AON在H_2O_2存在下于不同的时间点的水解率。采用荧光分光光度计测定AON在含或不含1 mM H_2O_2的PBS中的药物释放率,同时考察在模拟胃肠道环境下的释放情况。采用高效液相色谱法(HPLC)分别考察Ac2-26和AON在人工胃液、胃冲洗液、胃匀浆液,人工肠液、肠冲洗液、肠匀浆液中孵育2 h的稳定性。3.AON的细胞水平初步安全性和细胞摄取考察采用MTT法测试不同剂量的AON、ON、APN对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性。将FITC-AON与小鼠巨噬细胞RAW264.7共孵育一定时间,采用激光共聚焦显微镜观察纳米粒的细胞吞噬情况。另外,还通过流式细胞仪分析RAW264.7细胞中FITC-AON的荧光强度,同时考察纳米粒被细胞摄取的时间依赖性和剂量依赖性。4.AON的细胞水平抗氧化、抗炎效应考察采用膜联蛋白V/PI试剂盒考察了AON对高浓度H_2O_2导致的巨噬细胞凋亡的保护作用。采用荧光显微镜拍照观察和流式细胞术检测AON对PMA刺激RAW264.7细胞产生的ROS的抗氧化效应。考察AON对LPS刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α的抗炎效应。5.体外细胞实验考察AON对炎性细胞的影响在3%巯基乙酸盐诱导的小鼠腹腔灌洗液中提取中性粒细胞,Transwell小室考察AON对中性粒细胞迁移的影响。将中性粒细胞膜用DIO进行标记、自然凋亡后,流式细胞仪考察AON对巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞的影响。用LPS和IFN-γ刺激RAW264.7细胞,考察AON对巨噬细胞表型转化的影响。6.AON对急性结肠炎小鼠结肠靶向性研究DSS诱导的急性结肠炎小鼠口服Cy7.5-AON,在不同时间点处死小鼠,对其小肠、肠系膜淋巴结、肝、脾、肾、结肠以及血液进行活体成像,统计小鼠各脏器荧光强度。同样的,灌胃给予小鼠AON,在不同时间点处死小鼠,高效液相色谱(HPLC)测定结肠、血液、肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏和肾脏中Ac2-26的含量。给予小鼠灌胃FITC-AON4 h后,取小鼠结肠组织,切片采用激光共聚焦显微镜观察。给予小鼠灌胃Cy5-AON 4h后,用流式细胞仪检测纳米粒在结肠部位巨噬细胞和中性粒细胞的摄取量。7.AON对几种急慢性结肠炎小鼠模型的治疗作用评价C57BL/6小鼠饮用不同浓度的DSS建立小鼠急、慢性结肠炎模型。IL-10~(-/-)小鼠自发形成慢性结肠炎模型。按250μg/kg Ac2-26的剂量,按给药方案分别给予口服Ac2-26、ON、APN或AON。每日观察记录小鼠体重、粪便情况,实验结束后,处死小鼠,结肠拍照,测定结肠长度,采集血液进行血常规和肝肾功能分析,收集包括结肠在内的主要脏器进行切片,HE染色。检测结肠组织匀浆液中氧化应激相关指标MPO、MDA、H_2O_2和炎症因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ情况。通过肠镜和免疫荧光染色观察急性结肠炎小鼠治疗后的肠黏膜恢复情况。8.AON的体内初步安全性评价通过灌胃给予C57BL/6小鼠5 g/kg的AON进行急性毒性实验考察。在不同的时间点记录小鼠的体重,采集血样进行血常规和肝肾功能分析。取主要的脏器称重后固定,进行HE染色。9.AON体外抗炎和抗氧化作用机制研究采用非选择性甲酰肽受体(FPR)拮抗剂Boc2和选择性FPR2拮抗剂WRW4对AON抗炎、抗氧化、抗中性粒细胞迁移和促进巨噬细胞吞噬作用机制进行研究。10.AON对炎性细胞浸润和黏膜修复的影响急性结肠炎小鼠每日分别给予口服Ac2-26、ON、APN或AON。第7天实验结束后处死小鼠,流式细胞仪测定结肠组织中巨噬细胞和中性粒细胞数量或于7天各组小鼠灌胃给予FITC-Dextran,荧光分光光度光度计测定血液中FITC-Dextran荧光强度,从而评价AON对急性结肠炎小鼠肠黏膜修复的影响。11.AON对炎症消退的影响Balb/c小鼠腹腔注射酵母多糖建立小鼠急性腹膜炎模型。按Ac2-26剂量500 ng/只腹腔注射Ac2-26、ON、APN或AON,取腹腔灌洗液分别测定MDA、MPO、H_2O_2、TNF-α和IL-1β含量,流式细胞仪测定腹腔灌洗液中性粒细胞含量。在另外一项研究中,腹膜炎小鼠腹腔注射生理盐水或AON,分别于不同时间点取腹腔灌洗液测定中性粒细胞比例。12.AON对结肠炎小鼠肠道菌群的调节作用急性结肠炎小鼠每日分别给予口服生理盐水或AON。第7天实验结束后取小鼠粪便。16S rRNA检测肠道菌群种类和丰度,GC-MS测定粪便中短链脂肪酸的含量。结果1.基于β-CD和PBAP,合成了ROS响应性材料OxbCD,并对材料进行了FT-IR和~1H NMR表征。~1H NMR显示,一个β-CD骨架分子上大约共价键合了7个PBAP单元。通过纳米沉淀/自组装的方法可以制备得到包载Ac2-26的ROS响应性纳米粒AON,平均粒径为202±4 nm,zeta电位为-37.4±0.6 mV,包封率为42.8±2.8%,载药量为0.86±0.06μg/mg。AON在H_2O_2存在下能迅速发生水解和释放药物。HPLC测定Ac2-26溶液和纳米粒在各模拟胃、肠液中的稳定性,发现Ac2-26溶液在各模拟液中孵育2 h后,多肽发生了完全降解;而AON中,Ac2-26稳定存在,说明纳米粒对Ac2-26有很好的保护作用,稳定性大大提高。2.体外细胞实验表明,在1000μg/mL范围内AON对巨噬细胞RAW264.7生存率没有明显的影响。通过激光共聚焦显微镜和流式检测均表明RAW264.7细胞能够有效吞噬AON,且吞噬作用呈时间和剂量依赖性。另外,AON能明显抑制氧化应激介导的细胞凋亡,有效清除PMA刺激细胞产生的活性氧和LPS刺激细胞分泌的炎症因子TNF-α,并且其效果优于Ac2-26、空白载体纳米粒ON和PLGA制备的载药纳米粒APN。3.对炎性细胞的调控方面,AON可以抑制中性粒细胞的迁移,显著促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞,促进巨噬细胞表型从炎症性M1表型(F4/80~+CD86~+)转变为另一种活化的具有抗炎效应的M2表型(F4/80~+CD206~+)。4.急性结肠炎小鼠结肠靶向实验证明,Cy7.5-AON在急性溃疡性结肠炎小鼠结肠部分的荧光强度明显高于健康小鼠。小鼠灌胃口服Cy7.5-AON后,结肠部位荧光强度明显高于Cy7.5-Ac2-26溶液组。而Cy7.5-Ac2-26组在血液和与吸收,代谢和排泄有关的脏器中表现出更高的非特异性荧光分布,进一步证明AON的高效低毒特性。荧光共聚焦显微镜也能观察到FITC-AON具有更好的结肠炎靶向富集作用。HPLC检测发现Ac2-26组结肠组织中的药物含量在4 h和24 h时远低于AON组的Ac2-26含量。流式细胞术分析发现AON具有更好的炎性细胞靶向性,被炎性结肠的巨噬细胞和中性粒细胞摄取量更大。5.为评价AON对结肠炎的治疗效果,我们建立了DSS诱导的小鼠急性和慢性结肠炎模型以及IL-10~(-/-)小鼠自发形成的慢性结肠炎模型,口服AON进行干预治疗。结果发现,在上述的三种急、慢性结肠炎模型中,具有ROS响应性的AON能够有效缓解模型小鼠体重降低,减轻疾病指数和结肠黏膜炎症状况,降低模型小鼠结肠部位炎症因子和氧化应激相关指标的含量,同时对其他器官也并无明显毒性,其疗效优于Ac2-26、ON、Ac2-26和ON混合物以及APN。6.在体内初步的安全性评价实验中,通过灌胃给予5 g/kg AON后,小鼠的体重、脏器指数、血常规和肝肾功与正常小鼠相比无明显差异。同样,小鼠主要脏器的HE切片也没有发现明显病变。7.通过对AON抗炎和抗氧化应激的作用机制研究发现,AON主要通过FPR-1受体介导抑制氧化应激所致的RAW264.7细胞凋亡。而通过FPR-2受体介导降低LPS引起的TNF-α炎症因子分泌。也是通过激活FPR-2受体抑制中性粒细胞迁移以及促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞。8.AON处理能够减少DSS诱导的急性结肠炎小鼠结肠部位中性粒细胞和巨噬细胞的募集。通过灌胃给予各组处理小鼠FITC-Dextran反映肠段通透性变化,发现AON干预能够对结肠黏膜起到有效的保护作用,促进溃疡性创面的愈合。9.在小鼠腹膜炎模型中,与Ac2-26、ON以及APN相比,AON在治疗上表现出更优的效果。通过对腹膜炎小鼠腹腔灌洗液进行检测,测定其中的中性粒细胞比例以及氧化应激和炎症相关指标含量。结果显示,AON能够降低中性粒细胞浸润的最大数量(Ψmax)和减少中性粒细胞达到Ψmax的时间点与对应于~50%中性粒细胞减少的时间点之间的间隔(Ri),缓解氧化应激和降低炎症因子水平,加速炎症消退。10.AON干预能增加结肠炎小鼠肠道菌群多样性,减少感染性埃希氏菌-志贺氏菌的数量和提高短链脂肪酸(SCFAs)产生菌Prevotellaceae的丰度,同时增加SCFAs的含量,调节肠道菌群特征从失调状态转变为平衡状态。结论1.本课题通过β-CD与PBAP的共价键合,成功构建了一种ROS响应性载体材料OxbCD,将其包载抗炎多肽Ac2-26构建了具有抗氧化应激和和抗炎功能的纳米药物AON。并证明了AON具有特异性H_2O_2响应性,而且能够提高Ac2-26的稳定性。2.AON在细胞水平能够有效地被巨噬细胞吞噬,可以降低细胞氧化应激和炎症水平,抑制中性粒细胞迁移、促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞和诱导巨噬细胞从促炎型向抑炎型转化。3.AON口服后能够有效地靶向到结肠炎症部位和炎性细胞。在三种急慢性结肠炎模型中,AON能够有效地减轻氧化应激,抑制病变结肠组织的炎症反应,呈现良好的治疗效果。体内初步安全性评价表明,AON可以作为一种安全的口服纳米治疗药物。4.通过对AON抗结肠炎作用机制研究发现,AON通过激活FPR2发挥其抗炎作用,通过激活FPR1通路发挥降低氧化应激作用。AON可以减少炎性细胞浸润,促进炎症消退,恢复肠上皮屏障功能,增加肠道菌群多样性和SCFAs的含量,从而调节肠道炎症微环境。
【图文】：

Figure 2. Synthetic scheme of OxbCD.图2. OxbCD 的合成路线图。如图 2 所示，通过设计简单的迈克尔加成反应，，对 β-CD 修饰氧化应激响应性基团备得到 ROS 响应性的 β-CD 载体材料。2.1.2.2 OxbCD 的红外光谱表征4200 3600 3000 2400 1800 1200 600 -CDOxbCD

5.2.2 结 果Figure 52. Schematic illustration of treatment regimens.图52. 急性结肠炎模型的建立以及给药方案示意图。5.2.2.1 小鼠急性结肠炎病理学评价0 1 2 3 4 5 6 7708090100Weight(%)DaysNormalColitisONAPNAON*****Figure 53. The body weight of mice during a 7-day treatment course. Data are normalized as thepercentages of the body weight at day 0. **P < 0.01 and ***P < 0.001 versus the colitis group. All data arepresented as mean ±SE (n = 6).图53. DSS 诱导急性结肠炎小鼠在 7 天内的体重变化情况。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943;R96


本文编号：2642308