基于微流控技术的多功能siRNA脂质纳米粒的制备及抗肿瘤研究

发布时间：2020-04-27 13:39

【摘要】：小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)可以特异性沉默靶基因的表达,是治疗恶性肿瘤的重要新兴策略。但siRNA存在体内稳定性差、循环时间短、转染效率低、内涵体逃逸困难等问题。因此,构建有效的siRNA递送体系是高效沉默细胞内靶基因的重要前提。本课题结合工程学、材料学等多学科研究方法构建高效递送siRNA的纳米体系,并利用生物信息学分析确定细胞分裂周期蛋白20(Cell division cycle protein 20,CDC20)作为治疗靶点,旨在提高肿瘤治疗效果,并减少对正常组织的非特异性毒副作用。微流控(Microfluidic,MF)是指在纳米或微米级别的通道中操控微量流体的技术。流体在微小尺寸的流道内呈层流状态,且流体运动行为高度可控。与传统纳米粒制备方法相比,MF技术可以通过改变芯片形状、流体流速、流量、混合顺序等因素精密控制层流液体混合效应,是一种有效的合成粒径均一、批次质量可控的纳米粒的工程学工具。智能生物响应性材料可在机体特定生物环境(包括pH、氧化还原、酶、葡萄糖、乏氧、ATP)中发生溶胀、收缩、解离、降解等物理化学变化,由智能生物响应性材料组装形成的纳米粒可实现药物的精准释放,最大程度发挥药物作用,减小毒副作用。鉴于siRNA递送存在的问题及肿瘤组织特殊微环境,本研究采用MF技术制备了乏氧和pH双响应的多功能siRNA脂质纳米粒,并对其抗肿瘤效果进行了研究,具体内容概括如下:1.微流控技术制备基于pH响应的靶向siRNA脂质纳米粒及其抗肿瘤研究本研究设计了含有“人字形”被动混合器的MF芯片,用于制备基于pH响应的转铁蛋白靶向的siRNA脂质纳米粒(Tf-LNPs),并研究其体外和体内抗肿瘤效果。结果显示,我们通过MF芯片采用“一步法”简单高效地制备了Tf-LNPs,且与传统方法制备的脂质纳米粒相比,粒径分布更窄、显著改善了体内分布情况,显示了更强的抗肿瘤效果。这种基于MF技术开发的纳米载体为肿瘤治疗提供了新的策略和思路。2.乏氧响应的生物高分子材料的合成及治疗靶点的生物信息学分析首先我们通过2-硝基咪唑(2-Nitroimidazole,2-NI)和6-(叔丁基氨基)己基溴(6-(t-Boc-amino)hexyl bromide,BAHB)之间的偶联反应合成乏氧响应的6-(2-硝基咪唑)己胺(6-(2-nitroimidazole)hexylamine,NIHA);又以mPEG-NH_2为大分子引发剂引发γ-苯甲基-L-谷氨酸酯N-内羧酸酐(BLG NCA)开环聚合,并脱除苯甲基保护合成两嵌段共聚物mPEG-b-PLG;最后以EDC·HCl和NHS分别作为缩合剂和催化剂,将合成的NIHA与mPEG-b-PLG中LG结构单元的侧羧基结合,合成mPEG-b-P(LG-g-NI)。核磁共振图谱显示,所有信号峰均进行了准确归属,而且各个信号峰的积分比与结构式中氢的比例吻合,从而证明了NIHA、mPEG-b-PLG和mPEG-b-P(LG-g-NI)的成功合成。其次,通过生物信息学统计显示,在肿瘤组织中CDC20的过表达与乏氧呈正相关性,并与病人的不良预后密切相关。3.乏氧响应的siRNA纳米粒的制备及其抗肿瘤研究在乏氧条件下,2-NI可通过一系列硝基还原酶催化的单电子还原,转化为亲水性的2-氨基咪唑(2-Aminoimidazole,2-AI),在分子探针和前药聚合物中广泛应用。本研究将2-NI修饰的聚氨基酸共聚物mPEG-b-P(LG-g-NI)与阳离子类脂化合物组合形成乏氧响应纳米粒(Hypoxia-responsive nanoparticle,HRNP),用于递送CDC20 siRNA。体外结果表明,HRNP/siRNA在10.0 nM浓度时可高效敲除90%的靶基因,无明显细胞毒性;体内实验表明,HRNP/siRNA在肿瘤组织中具有较高的肿瘤积聚,与空白对照相比,体内的抑瘤率高达85%,有效抑制肿瘤的生长。4.微流控制备乏氧与酸双响应的siRNA纳米粒及其抗肿瘤研究基于上述研究基础,本研究采用微流控技术,制备合成了乏氧-pH双响应的siRNA脂质纳米粒(Hypoxia and pH dual-responsive lipid nanoparticle,hpLNP),并对体内外siRNA沉默效果进行了考察。实验结果表明,该hpLNP纳米粒粒径均一,在pH=6.5条件下,hpLNP质子化和PEG外壳的脱落导致电位由负变正,增加了肿瘤细胞的摄取。进入细胞后,hpLNP在乏氧条件下的快速释放siRNA,最终达到肿瘤靶向以及高效的基因沉默效果。综上所述,本研究设计了新型MF芯片,能够通过“一步法”制备粒径均一的纳米粒,结合乏氧及pH响应性材料,能够高效递送siRNA并介导基因沉默,达到抑制肿瘤生长的目的。这种微流控技术结合响应性高分子材料制备纳米粒的策略具有简单、可控、重复性高的特点和优势,在siRNA纳米递送体系的临床转化方面具有良好的应用前景。
【图文】：

RNA分子,外源性,双链,核苷酸

第 1 章绪论简介定义及其作用机制A（Small interfering RNA, siRNA）是由 Dicer 蛋白剪RNA（Double-strand siRNA, dsRNA）得到的具有 21 该 siRNA能够在Dicer蛋白的帮助下，与Ago蛋白结合（RNA-induced silencing complex, RISC），其中正义与靶基因通过碱基互补配对，诱导靶基因的特异性剪现象[3-6]，此机制被称为 RNA 干扰（RNA interfering

第 1 章绪论酸酶降解等因素，致使其具有半衰期短，转染效率低的缺点。siRNA 需要克服重重障碍才能达到高效的 RNAi 效果。具体地，当 siRNA 经静脉注射进入血液后，，需要依次克服血液中核酸酶的降解，避免肾脏的消除，并穿过血管内皮细胞，进入各组织器官。到达组织内后的 siRNA 又需与靶细胞结合，通过内吞机制进入细胞，并成功从溶酶体内逃逸到达细胞质，才能真正发挥 RNAi 作用。因此，能否高效递送 siRNA 是目前亟待解决的问题之一[9, 10]。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96;R943

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