甲基强的松龙激活自噬抑制肝脏脂肪累积及炎症减轻LPS诱导的肝损伤

发布时间：2020-04-28 01:05

【摘要】：脂代谢异常可参与许多重症疾病导致的器官功能障碍或衰竭过程。肝脏是维持脂代谢稳态的重要器官,在维持机体脂质代谢稳态中发挥重要作用,但也是脓毒症多器官功能障碍中最容易受累的器官之一。脓毒症肝损伤的发生发展与脂代谢稳态及患者预后密切相关,是脓毒症患者预后不良的危险因子。如何维持肝脏代谢稳态、防治脓毒症肝损伤逐渐成为重症医学的关注热点。本研究着该热点入手,共分为两部分,第一部分采用腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的方法来构建内毒素血症引发的肝损伤小鼠模型,探讨糖皮质激素(甲基强的松龙,简称甲强龙,Methylprednisolone,MP)对脓毒症肝损伤的治疗作用及相关机制。第二部分在LPS诱导内毒素血症肝损伤条件下,探讨甲基强的松龙(MP)通过调节自噬在LPS诱导的肝脏脂代谢紊乱中的作用。第一部分:甲基强的松龙减轻脂多糖诱导的肝功能损伤及高脂血症【目的】探讨甲基强的松龙(methylprednisolone,MP)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导肝损伤的影响和机制。【方法】8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、LPS组(分腹腔注射LPS 2h,4h,8h,24h处理组)和MP+LPS组(n=5)。LPS组小鼠腹腔注射LPS(5 mg/kg)制作内毒素血症模型,MP+LPS组腹腔注射LPS(5 mg/kg)+MP(2 mg/kg/d)24h,对照组腹腔注射等容量生理盐水。苏木精-伊红(HE)染色观察各组肝组织病理学变化。检测小鼠血清样本ALT、AST、非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)、甘油三酯(triglyceride,TG)、胆固醇(cholesterol,CHOL)水平。酶联免疫吸附法检测小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平;荧光实时定量PCR检测肝组织Tnf-α、Il-1β、Il-6 mRNA水平。【结果】(1)MP+LPS组小鼠精神萎靡,活动减少,蜷缩冷战,疼痛刺激反应情况较LPS处理各组好。(2)HE病理切片提示LPS处理可见小鼠肝组织损伤表现,并随时间延长而逐渐加重;与LPS处理小鼠相比,MP处理内毒素血症小鼠肝组织病理损伤均有不同程度改善。(3)LPS处理不同时间后,小鼠血清中ALT、AST、NEFA、TG、CHOL水平显著高于正常小鼠。加入MP处理后血清中ALT、AST、NEFA、TG、CHOL水平较LPS组显著下降(P0.05)。(4)LPS刺激条件下,小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平整体呈上升趋势,并且在不同时间点出现最高水平。肝脏Tnf-α、Il-1β、Il-6 mRNA相对表达量整体呈增加趋势。加入MP处理后,MP+LPS组肝脏Tnf-α、Il-1β、Il-6 mRNA相对表达量显著低于单纯LPS组(P0.05)。【结论】甲基强的松龙能减轻LPS诱导的高炎症因子反应及高脂血症,降低血脂和炎症水平,改善脓毒症肝损伤。第二部分:甲基强的松龙诱导自噬减轻肝脏脂肪累积及炎症,缓解肝功能损伤【目的】研究LPS诱导的内毒素血症肝损伤条件下,甲基强的松龙(methylprednisolone,MP)调节自噬对肝脏脂肪代谢的影响。【方法】45只8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为9组(n=5)。采用实时荧光定量聚合酶链反应技术(RT-qPCR)测肝脏Fasn、Scd-1、Ppar-γ、Ppar-α、Cpt-1、Tnf-α、Il-1β、Il-6的mRNA表达水平;免疫蛋白印迹法(western blot)测定肝脏FASN、SCD-1、PPAR-γ及自噬蛋白LC3 II/I和凋亡蛋白Caspase-3表达水平。【结果】(1)5 mg/kg LPS处理后,小鼠肝脏炎症因子Tnf-α、Il-1β、Il-6 mRNA表达显著高于正常对照组,随着刺激时间延长,仍维持在较高水平(P0.05)。加入MP处理后,LPS小鼠肝脏炎症因子Tnf-α、Il-1β、Il-6 mRNA表达水平较LPS组表达下降(P0.05)。(2)LPS刺激下,肝脏Fasn、Scd-1、Ppar-γ、Ppar-αmRNA水平较对照组明显下调,Cpt-1mRNA表达出现一过性增加(P0.05)。与LPS组比较,加入MP处理后,MP+LPS组小鼠肝脏Fasn、Scd-1、Ppar-γ、Ppar-α、Cpt-1 mRNA表达水平较LPS组增加(P0.05)。(3)LPS处理24 h,FASN、SCD-1、PPAR-γ蛋白表达明显被抑制,MP处理改善LPS对FASN、SCD-1、PPAR-γ蛋白表达抑制作用(P0.05)。(4)LPS处理显著促进小鼠肝脏Caspase-3蛋白表达,肝组织自噬LC3 II/I蛋白表达呈2h内激活而后抑制的变化趋势。LPS处理24h,MP明显增加LC3 II/I蛋白表达,抑制凋亡蛋白Caspase-3表达(P0.05)。【结论】甲基强的松龙通过激活自噬调节肝脏脂代谢稳态,抑制肝脏炎症反应,改善肝功能,减少肝细胞凋亡,缓解LPS诱导的内毒素血症肝损伤。
【图文】：

示意图,给药,示意图,冰箱

物分组注射5 mg/kg LPS制作小鼠内毒素血症肝损伤模型，制模条[60]。动物随机分批分组：A批处理为LPS刺激不同时间点ontrol组），LPS组（LPS分别处理 2 h, 4 h, 8 h, 24 h后处果研究，分别为对照组（Control组）、LPS组（LPS处理22 mg/kg MP）、MP+LPS组（LPS处理1h后腹腔注射MP组按腹腔注射LPS后0h、2 h、4 h、8 h、24 h经戊巴比妥麻醉组织；B批小鼠MP+LPS组按照LPS（5 mg/kg）处理1h后腹腔注射等量生理盐水，，24 h经戊巴比妥麻醉后处死并收取程图见图 6。血清存放于4℃冰箱，24h内检测。病理组织，肝组织经液氮瞬时冷冻后转移至-80℃冰箱，备用。

组织脂肪,相关蛋白,小鼠,表达水平

水组）比较P < 0.05；# 表示与LPS 组比较P < 0.05图 9. 小鼠肝组织脂肪酸合成相关蛋白表达变化（24h）Figure 9. The protein levels of fatty acid synthesis in livers of mice组织脂肪氧化相关基因表达检测常对照小鼠比较，LPS刺激小鼠其肝脏脂肪氧化相关基因包对表达水平受到明显抑制，统计学差异有显著意义（P<0.05）；延长，基因Cpt-1 mRNA的相对表达水平在4h时出现一过性增高（小鼠24h，肝组织内Ppar-α、Cpt-1 mRNA相对表达量（0.76 0.19）与正常对照小鼠（1.02± 0.14，1.00 ± 0.09）无明显统计学较，MP+LPS组Ppar-α、Cpt-1 mRNA相对表达量（0.91 ± 0.升高（P=0.431，P=0.013）（图10 II）。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965

【参考文献】