PINK1在调控顺铂及庆大霉素耳毒性中的机制研究

发布时间：2020-04-28 06:58

【摘要】：第一部分PINK1在顺铂所致耳毒性中的作用机制研究Study on the Mechanism underlying the actions of PINK1 in Cisplatin-induced Ototoxity研究目的:临床上行之有效且应用广泛的化疗药——顺铂,能够产生以耳鸣、耳聋为主的副作用,其耳毒性具有不可逆性,因而极大地限制了其临床应用。顺铂的耳毒性机制复杂,研究表明主要涉及活性氧(ROS)的累积增加、线粒体功能障碍、细胞自噬和细胞凋亡等,但其确切机制尚不明了。同源性磷酸酶-张力蛋白诱导的激酶1(phosphatase and tensin homologue(PTEN)-induced putative kinase 1,PINK 1)作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在对抗外源性氧化胁迫、线粒体稳态调节、减轻内质网应激、协调细胞内运输等方面发挥广泛的调控作用。目前PINK1在耳科学领域还没有研究,本研究旨在探索PINK 1在C57BL/6小鼠耳蜗及HEI-OC1细胞系中的表达情况,在此基础上,探究其在顺铂所致耳毒性中是否发挥一定的调控作用,从而阐明顺铂耳毒性的新机制,为顺铂耳毒性的预防治疗提供新思路。实验方法:(1)选取新生4天、2个月的成年C57BL/6小鼠及HEI-OC1细胞,以脑组织为阳性对照,应用免疫荧光法观察PINK1在C57BL/6小鼠耳蜗各个部位的表达情况,并应用WB法对其在耳蜗毛细胞、神经元及HEI-OC1细胞内的表达情况进行半定量分析。(2)CCK8法检测不同浓度顺铂对HEI-OC1细胞活力的影响,筛选出有效的药物浓度及作用时间。(3)1010 DCFH-DA或5 μM Mito-SOX Red染色,流式细胞法及荧光显微镜观察法检测顺铂及顺铂联合应用ROS抑制剂2 mM NAC或40 μg/ml PEG-catalase刺激下ROS产生水平(联合处理组需先用ROS抑制剂预处理1-2h,后将抑制剂与顺铂联合加入)。(4)WB法检测顺铂及顺铂联合应用ROS抑制剂NAC或PEG-catalase刺激后,细胞内PINK1的表达情况,免疫荧光法检测PINK1下游分子parkin的形态、分布及颗粒数目,罗丹明123及TMRM染色,流式细胞法及荧光显微镜观察法检测各组线粒体膜电位情况。(5)Tom 20、Mitotracker-deep Red及Lamp-1共定位标识线粒体自噬,并通过WB法、免疫荧光法、TUNEL法及流式细胞法检测凋亡相关蛋白p-JNK及细胞凋亡情况。(6)应用PINK1-siRNA沉默其在HEI-OC1中的表达,WB法、免疫荧光法及流式细胞法检测PINK1沉默情况下,顺铂诱导细胞自噬及JNK相关凋亡水平的变化。(7)应用PINK1-siRNA沉默其在HEI-OC1中的表达,顺铂联合应用自噬抑制剂5 mM 3-MA或JNK信号通路抑制剂10 μM SP(联合处理组需先用抑制剂预处理1-2h,后将抑制剂与顺铂联合加入),CCK8法检测细胞的生存率。(8)体外培养小鼠耳蜗基底膜,WB法、免疫荧光法、TUNEL法检测顺铂及顺铂联合应用ROS抑制剂NAC或PEG-catalase刺激下PINK1的表达变化、parkin的形态分布、组织内ROS水平、毛细胞线粒体膜电位情况、自噬及凋亡情况。(9)体外培养小鼠耳蜗螺旋神经节神经元,WB法、免疫荧光法、TUNEL法检测顺铂及顺铂联合应用ROS抑制剂NAC或PEG-catalase刺激下PINK1的下游分子parkin的形态分布、组织内ROS水平、神经元线粒体膜电位情况、自噬及凋亡情况。实验结果:(1)PINK1在C57BL/6小鼠耳蜗HCs、SGNs、血管纹和HEI-OC1细胞的细胞质中广泛点状表达,值得注意的是,出生后第4天(P4)小鼠耳蜗HCs和SGNs的表达水平高于成年小鼠,我们后续将以新生小鼠耳蜗及HEI-OC1细胞为主要研究材料。(2)30 μM顺铂处理HEI-OC1细胞能够引起时间依赖性活性氧(ROS)的形成,表现为DCFH-DA及Mito-SOX Red 阳性细胞比例逐步增加;顺铂联合应用活性氧清除剂NAC或H202抑制剂PEG-catalase能够有效或部分抑制细胞内ROS的生成。(3)30 μM顺铂处理HEI-OC1细胞能够引起线粒体膜电位的损伤;顺铂联合应用活性氧清除剂NAC或H202抑制剂PEG-catalase能够减轻线粒体膜电位的损伤。(4)30μ顺铂处理HEI-OC1细胞能够引起PINK1的表达呈波动性变化,及其下游parkin分子的聚集、线粒体自噬的形成和p-JNK相关的细胞凋亡;抑制ROS水平能够减少parkin颗粒数目、线粒体自噬及p-JNK相关的细胞凋亡程度。(5)干扰HEI-OC1细胞内的PINK1表达,能够减轻顺铂所致的PINK1信号通路的激活、细胞自噬,但是p-JNK相关凋亡水平增加。(6)SP抑制JNK信号通路能够提高细胞存活率,3-MA抑制细胞自噬能够降低细胞存活率。(7)顺铂处理体外培养的P4小鼠耳蜗基底膜,能够引起毛细胞内ROS水平增加、线粒体膜电位的受损、PINK1/parkin信号通路的激活、自噬及凋亡水平的增加;联合应用ROS抑制剂能够减轻毛细胞内ROS水平、线粒体膜电位的受损、PINK1/parkin信号通路的激活、自噬及凋亡水平。(8)顺铂处理体外培养的P4小鼠耳蜗蜗轴,能够引起SGNs内ROS水平增加、线粒体膜电位的受损、PINK1/parkin信号通路的激活、自噬及凋亡水平的增加;联合应用ROS抑制剂能够减轻毛细胞内ROS水平增加、线粒体膜电位的受损、PINK1/parkin信号通路的激活、自噬及凋亡水平。结论:首次将PINK1在C57BL/6小鼠耳蜗内进行定位,并初步探讨了 PINK1在顺铂所致耳毒性中的调节功能,结果表明,PINK1信号通路可以通过激活线粒体自噬及抑制p-JNK相关的凋亡途径,起到对抗顺铂引起的损伤作用;并且PINK1信号通路的激活程度受顺铂所诱导的ROS水平影响。第二部分PINK1在庆大霉素所致耳毒性中的机制研究Study of the Mechanism of PINK1 in Gentamicin(GM)-induced Ototoxity研究目的:包括庆大霉素在内的氨基糖苷类抗生素因其抗菌谱广及价格低廉在临床上广泛使用,但是其耳毒性副作用降低了患者的生活质量,也限制了其在临床的应用。氨基糖苷类抗生素引起的感音神经性聋主要集中于耳蜗毛细胞的损伤,其机制主要涉及氧化应激损伤、细胞自噬、凋亡等,我们前期研究表明PINK1信号通路在顺铂所致的耳毒性中具有一定的保护作用,而PINK1的保护作用是否具有普遍性还未可知,因而我们希望通过探讨PINK1信号通路在庆大霉素所致的耳毒性中可能的调控机制,为常见药物性聋的防治提供新思路。实验方法:(1)400 μM庆大霉素及400 μM庆大霉素联合应用ROS抑制剂2 mM NAC处理体外培养HEI-OC1细胞(联合处理组需先用ROS抑制剂预处理1-2h,后将抑制剂与庆大霉素联合加入),DCFH-DA染色,流式细胞法及荧光显微镜观察法检测细胞内ROS产生水平。(2)WB法检测庆大霉素及庆大霉素联合应用ROS抑制剂NAC后,细胞内PINK1的表达变化,免疫荧光法检测PINK1的下游分子parkin的形态、分布及颗粒数目,罗丹明123染色,流式细胞法及荧光显微镜观察法检测各组线粒体膜电位情况。(3)Tom 20及Lamp-1共定位标识线粒体自噬,并通过WB法、免疫荧光法及CCK8法检测凋亡相关蛋白p53及细胞存活情况。(4)应用PINK1-siRNA沉默其在HEI-OC1中的表达,WB法、免疫荧光法、流式细胞法及TUNEL法检测PINK1沉默情况下,庆大霉素诱导的细胞内ROS水平、线粒体膜电位情况、PICNK1/parkin信号通路激活情况、细胞内自噬及p53相关凋亡水平。(5)应用PINK1-siRNA沉默其在HEI-OC1中的表达,庆大霉素或联合应用自噬抑制剂5 mM 3-MA、p53信号通路抑制剂10 μM PFTα处理后,CCK8法检测细胞的生存率(6)体外培养小鼠耳蜗基底膜,WB法检测庆大霉素及庆大霉素联合应用ROS抑制剂NAC刺激下PINK1的表达变化。(7)免疫荧光法检测庆大霉素及庆大霉素联合应用ROS抑制剂NAC刺激下耳蜗毛细胞内parkin的分布、组织内ROS水平、毛细胞线粒体膜电位情况。(8)免疫荧光法、WB法及TUNEL法检测庆大霉素及庆大霉素联合应用ROS抑制剂NAC刺激下耳蜗毛细胞自噬及凋亡情况。实验结果:(1)400 μM庆大霉素处理HEI-OC1细胞能够引起时间依赖性ROS的形成,表现为DCFH-DA 阳性细胞比例逐步增加;庆大霉素联合应用活性氧清除剂NAC能够有效抑制细胞内ROS的生成。(2)400 μM庆大霉素处理HEI-OC1细胞能够引起线粒体膜电位的损伤;庆大霉素联合应用活性氧清除剂NAC能够减轻线粒体膜电位的损伤。(3)400 μM庆大霉素处理HEI-OC1细胞能够引起PINK1的表达呈波动性变化,及其下游parkin分子的聚集、线粒体自噬的显著增加及p53表达水平增加;抑制ROS水平能够减少parkin颗粒数目、线粒体自噬及p53表达水平。(4)干扰HEI-OC1细胞内的PINK1表达,能够减轻庆大霉素所致的PINK1信号通路的激活、细胞自噬,但是p53相关凋亡水平增加。(5)PFTα抑制p53信号通路能够提高细胞存活率,3-MA抑制细胞自噬能够降低细胞存活率。(6)庆大霉素处理体外培养的P4小鼠耳蜗基底膜,能够引起毛细胞内ROS水平增加、线粒体膜电位的受损、PINK1/parkin信号通路的激活、自噬及凋亡水平的增加;联合应用ROS抑制剂能够减轻毛细胞内ROS水平、线粒体膜电位的受损、PINK1/parkin信号通路的激活、自噬及凋亡水平。结论:本研究表明PINK1信号通路可以通过激活线粒体自噬及抑制p53信号通路,起到对抗庆大霉素引起的毛细胞损伤作用;并且PINK1信号通路的激活程度受庆大霉素所诱导的ROS水平影响。推断PINK1在抵抗耳毒性药物引起的损伤方面可能具有普遍性,为药物性聋病的治疗和预防提供了新的调控靶点。
【图文】：

耳蜗,箭头,胞质,神经元

１．邋ＰＩＮＫ１在Ｃ５７ＢＬ／６小鼠耳蜗及ＨＥＩ－ＯＣ１细胞中表达逡逑首先，我们以２月龄的成年Ｃ５７ＢＬ／６小鼠耳蜗为研究对象，以高表达逡逑ＰＩＮＫ１的小鼠脑组织为阳性对照（图１Ａ），发现ＰＩＮＫ１在成年Ｃ５７ＢＬ／６小逡逑鼠耳蜗ＩＨＣｓ邋（图１Ｂ－１，绿色箭头）、ＯＨＣｓ邋（图１Ｂ－１，黄色箭头）、ＳＧＮｓ逡逑（图１Ｃ，黄色箭头）、血管纹（图１Ｂ－２，蓝色箭头）等的细胞质中广泛点逡逑状表达。为了更好的展示毛细胞，我们又对基底膜进行了铺片免疫荧光染色，逡逑ＰＩＮＫ１在新生小鼠耳蜗毛细胞内的表达形式（图２Ｂ，黄色、绿色箭头）与逡逑其在成年鼠耳蜗毛细胞（图２Ａ，黄色、绿色箭头）内表达相似，另外逡逑ＰＩＮＫ１也点状表达在细胞外的组织内（图２Ｂ，蓝色箭头）及ＨＥＩ－ＯＣ１细胞逡逑内（图２Ｃ，黄色箭头）。值得注意的是，ＷＢ结果证实ＰＩＮＫ１在Ｐ４小鼠逡逑耳蜗ＨＣｓ和ＳＧＮｓ的表达水平高于成年小鼠。ＰＩＮＫ１在耳蜗ＨＣｓ、ＳＧＮｓ及逡逑ＨＥＩ－ＯＣ１细胞内的表达为其在顺铀所致耳毒性中的可能机制研究提供了必要逡逑的基础。我们后续将以新生小鼠耳蜗ＨＣｓ、ＳＧＮｓ及ＨＥＩ－０Ｃ１细胞系为研究逡逑对象

耳蜗,箭头,小鼠,蓝色

黄色箭头）、血管纹（图１Ｂ－２，蓝色箭头）等的细胞质中广泛点逡逑状表达。为了更好的展示毛细胞，我们又对基底膜进行了铺片免疫荧光染色，逡逑ＰＩＮＫ１在新生小鼠耳蜗毛细胞内的表达形式（图２Ｂ，黄色、绿色箭头）与逡逑其在成年鼠耳蜗毛细胞（图２Ａ，黄色、绿色箭头）内表达相似，另外逡逑ＰＩＮＫ１也点状表达在细胞外的组织内（图２Ｂ，蓝色箭头）及ＨＥＩ－ＯＣ１细胞逡逑内（图２Ｃ，黄色箭头）。值得注意的是，ＷＢ结果证实ＰＩＮＫ１在Ｐ４小鼠逡逑耳蜗ＨＣｓ和ＳＧＮｓ的表达水平高于成年小鼠。ＰＩＮＫ１在耳蜗ＨＣｓ、ＳＧＮｓ及逡逑ＨＥＩ－ＯＣ１细胞内的表达为其在顺铀所致耳毒性中的可能机制研究提供了必要逡逑的基础。我们后续将以新生小鼠耳蜗ＨＣｓ、ＳＧＮｓ及ＨＥＩ－０Ｃ１细胞系为研究逡逑对象，进行顺销耳毒性的机制研究。逡逑３８逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965

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