LSD1小分子抑制剂筛选方法的建立及其抑制剂的筛选和抗肿瘤活性研究

发布时间：2020-05-02 19:08

【摘要】：表观遗传学研究的是在DNA序列没有改变的情况下,由染色体变化引起的可遗传的表型变化。常见的染色体变化有DNA修饰、RNA修饰与组蛋白修饰等。组蛋白修饰是调节转录调控中重要的一部分。本文研究对象组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1是第一个被确定的组蛋白去甲基化酶,可以特异性地去除组蛋白H3K4和H3K9单双甲基。据报道,LSD1在多种癌症中过表达,如胃癌和白血病。LSD1功能的抑制可以降低癌细胞的增殖和转移能力,因此获取高效靶向LSD1抑制剂将成为癌症治疗新策略。目前LSD1抑制剂筛选方法较为有限,多为检测抑制剂对LSD1抑制活性,在检测抑制剂对LSD1靶向结合能力方面略有不足。且一些实验方法例如基于H_2O_2定量的方法,无法评价与H_2O_2反应的化合物,具有一定局限性。因此建立多角度筛选方法可弥补筛选的局限性。待使用建立的筛选方法筛选得到分子水平活性较好的抑制剂后,对抑制剂进行进一步细胞水平抗肿瘤活性研究,为LSD1抑制剂进一步设计与优化提供新思路。本课题围绕以下问题开展:(1)LSD1截断体重组蛋白的表达与纯化本课题使用亲和层析法与离子交换色谱柱法对LSD1截断体重组蛋白进行纯化,获得纯度95%的LSD1截断体重组蛋白,可满足后期抑制剂筛选与酶动力学研究需求。(2)LSD1抑制剂筛选方法建立本课题从化合物对酶抑制活性检测、化合物与靶标结合以及酶-配体动力学三个角度进行了LSD1抑制剂筛选方法建立的实验设计。课题首先表达并纯化了甲醛脱氢酶,通过定量甲醛从而定量了LSD1去甲基化活性及小分子抑制剂对LSD1活性的抑制能力;其次使用染料SYPRO Orange实时监测荧光值,反应化合物与蛋白的结合;最后本课题应用表面等离子共振技术实现了对抑制剂的筛选并获得相应酶动力学数据,弥补了现有LSD1抑制剂筛选方法无法评价抑制剂对LSD1靶向结合动力学的不足。(3)新型LSD1抑制剂抗肿瘤活性的研究本课题组通过对组内化合物库的筛选与优化,得到一个二苯乙烯类、一个吲哚衍生物类及两个三唑并嘧啶类共四个高效LSD1靶向抑制剂,并在分子水平和细胞水平进行了活性评价。新型二苯乙烯类LSD1抑制剂DYC-8c在分子水平通过FAD竞争的方式可逆地抑制LSD1活性,所得IC_(50)=0.28μM,且以快结合(Kon=1.82×10~3 1/(M?s))、慢解离(Koff=1.00×10~-22 1/s)的方式作用于LSD1。在细胞水平,DYC-8c促进白血病THP-1细胞白细胞分化抗原CD86的表达并促进其髓样分化,抑制其增殖与克隆形成能力,IC_(50)为5.76μM。此外,它还能使THP-1细胞中LSD1底物H3K4me2的累积逐渐增加,说明其在细胞内同样靶向抑制LSD1的活性。新型不可逆吲哚衍生物类LSD1抑制剂XHW-9e为首个非单胺氧化酶抑制剂类的不可逆LSD1抑制剂,分子水平对LSD1 IC_(50)=1.23μM,并提高LSD1的稳定性,说明其有效地靶向LSD1重组蛋白,且同样以快结合(Kon=2.98×10~31/(M?s))、慢解离(Koff=6.05×10~(-2)1/s)的方式靶向作用于LSD1。细胞水平,XHW-9e可有效抑制THP-1的增殖与克隆形成能力,增殖抑制IC_(50)为1.20μM,促进了CD86的表达,促进了髓样分化。新型三唑并嘧啶类LSD1抑制剂WS-996以可逆的形式通过竞争FAD从而抑制LSD1蛋白活性,IC_(50)=34.45 nM。在THP-1中可达到IC_(50)=1.65μM的细胞增殖抑制作用,促进THP-1的分化,有效提升细胞内LSD1热稳定性,说明其靶向细胞内LSD1并发挥作用。新型三唑并嘧啶类LSD1抑制剂WS-812与WS-996相比,具有相似的分子水平活性抑制能力与作用方式,IC_(50)=38.15 nM,K_D=6.23μM。此外,WS-812不仅对白血病THP-1细胞具有细胞增殖、克隆形成的抑制作用与促分化作用,而且可以较好地抑制胃癌细胞MGC-803的细胞增殖,有效抑制其克隆形成与转移能力。综上所述,本课题首次使用两步法得到高纯度LSD1重组蛋白,并首次根据副产物定量、蛋白热稳定性与表面等离子共振原理建立了三个LSD1抑制剂筛选方法,发现了四个新型LSD1抑制剂,其中三个为可逆抑制剂,一个为首个非单胺氧化酶抑制剂类的不可逆抑制剂。后期的抑制剂生物活性评价结果揭示了抑制剂的抗肿瘤活性,为新型靶向LSD1抗肿瘤药物的开发提供了重要的依据。
【图文】：

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图 1.1 核小体“串珠模型”结构NA 修饰A 的主要修饰为 DNA 甲基化。在真核细胞中，DNA 的 CpG CpGIs）二核苷酸胞嘧啶在合成后被 DNA 甲基转移酶ansferase，，DNMT）将 S-甲硫腺苷（S-adenosylmethionine，SA胞嘧啶的 C5 位置，转化为 5-甲基胞嘧啶（5-methycytosine，5修饰[11]（图 1.2）。DNA 的甲基化可以抑制转录因子与 DNA 募具有抑制基因表达功能的酶，从而造成基因沉默[12]。因此 D组关键的表观遗传修饰，参与许多细胞过程，包括基因转录、胚失活、染色体稳定和基因组印记等[13]。

甲基化

图 1.1 核小体“串珠模型”结构修饰为 DNA 甲基化。在真核细胞中，DNA 二核苷酸胞嘧啶在合成后被 DNA 甲基，DNMT）将 S-甲硫腺苷（S-adenosylmethion的 C5 位置，转化为 5-甲基胞嘧啶（5-methycy（图 1.2）。DNA 的甲基化可以抑制转录因子与抑制基因表达功能的酶，从而造成基因沉默[12]的表观遗传修饰，参与许多细胞过程，包括基因染色体稳定和基因组印记等[13]。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R91;R96

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