七叶皂苷与糖皮质激素联用对大鼠佐剂性关节炎的保护作用及其机制

发布时间：2020-05-03 18:07

【摘要】：研究背景:类风湿性关节炎是以慢性关节滑膜炎症为主要表现的一种自身免疫性疾病。糖皮质激素是《类风湿性关节炎诊断及治疗指南》推荐使用的治疗药物,但是长期、大剂量使用会产生免疫抑制、骨质疏松等严重副作用。我们课题组前期研究显示,七叶皂苷能够增强低剂量糖皮质激素的抗关节炎作用,但是详细作用机制不清,有待进一步阐明。研究意义:明确七叶皂苷与糖皮质激素联用对类风湿性关节炎的保护作用及其机制,为临床联合用药提供实验依据。研究方法:一、体内实验:制备SD大鼠佐剂性关节炎模型,随机分为模型组(AIA)、地塞米松高剂量(DEX,0.2 mg/kg)组、地塞米松低剂量(DEX,0.05 mg/kg)组、七叶皂苷(ESCIN,10 mg/kg)组、地塞米松低剂量+七叶皂苷(DEX 0.05+ESCIN)组,每组10只,另取10只同背景SD大鼠作为正常对照(Control)组。造模成功后各组灌胃(ig.)给予相应药物或溶媒,1次/d,连续14 d。1.足肿胀及病理检测:造模前后每隔3 d用足跖容积测量仪检测大鼠后肢原发侧与继发侧关节肿胀变化;苏木精和伊红(H-E)染色观察足跖病理变化。2.炎症因子检测:Elisa法检测大鼠血清TNF-α、IL-6炎症因子。3.免疫器官病理检测:取脾脏、胸腺称重,计算免疫器官指数;并通过H-E染色观察病理变化;4.糖皮质激素受体(GR)及其下游炎症通路检测:基因芯片检测大鼠继发侧肿胀关节滑膜组织GR信号通路基因表达;Western blot检测大鼠关节滑膜GR、核因子κB p65(NF-κB p65)、IκB-α以及磷酸化p65、磷酸化IκB-α蛋白表达。二、体外实验:用LPS刺激小鼠RAW 264.7巨噬细胞制备炎症模型,分为Control组、LPS组、DEX高剂量(50 n M)组、DEX低剂量(12.5 n M)组、ESCIN 10μM组、DEX+ESCIN(12.5 n M+10μM)组,每孔加入相应药物,培养2 h后加入LPS 2μl(终浓度1μg/m L)致炎。1.炎症因子检测:LPS作用24 h后Griess法检测细胞上清NO表达;作用6 h后Elisa法测定细胞上清TNF-α、IL-6炎症因子浓度;2.GR及其下游炎症通路检测:LPS作用1 h后,RT-PCR检测GR m RNA表达;作用6 h后Western blot检测大鼠关节滑膜GR、p65、IκB-α以及磷酸化p65、磷酸化IκB-α蛋白水平。结果:一、体内实验结果:1.对关节肿胀影响:与Control组相比,AIA组大鼠原发侧和继发侧关节肿胀率及关节肿胀指数明显升高(P0.01),关节组织出现滑膜增生与软骨破坏;与AIA组相比,DEX高剂量和DEX低剂量+ESCIN联合用药均显著抑制大鼠关节肿胀率及关节肿胀指数(P0.01),关节滑膜增生与软骨破坏亦明显减轻;与DEX低剂量组相比,DEX低剂量+ESCIN联合用药对关节肿胀率及关节肿胀指数抑制效果增强,关节破坏减轻。2.对炎症因子影响:与Control组相比,AIA组大鼠血清TNF-α及IL-6含量显著升高(P0.01);与AIA组相比,DEX高剂量和DEX低剂量+ESCIN联合用药可显著降低血清TNF-α及IL-6含量(P0.01);与DEX低剂量组相比,DEX低剂量+ESCIN联合用药对血清TNF-α及IL-6炎症因子抑制作用增强。3.对免疫器官的影响:与Control组相比,AIA组大鼠胸腺无明显萎缩,脾脏略有增大;DEX高剂量组大鼠脾脏、胸腺严重萎缩(P0.01),脾脏淋巴小结数量明显减少,胸腺皮质变薄,胸腺细胞数量明显减少,细胞胞浆内有空泡形成;与DEX高剂量组相比,DEX低剂量+ESCIN组大鼠脾脏与胸腺萎缩明显减轻。4.对GR及其下游炎症通路影响:与Control组相比,AIA组大鼠关节滑膜组织GR(Nr3c1)基因表达明显下调(P0.01),TNF-α及IL-6基因表达明显上调(P0.01);与AIA组和单用DEX组相比,DEX低剂量+ESCIN联合用药组大鼠关节滑膜组织Nr3c1基因表达明显上调(P0.01);与Control组相比,AIA组大鼠关节滑膜组织GR蛋白表达明显降低(P0.05),p65及磷酸化p65、磷酸化IκB-α蛋白表达明显升高(P0.05);与AIA组相比,DEX低剂量+ESCIN联合用药组大鼠关节滑膜组织GR蛋白表达明显升高(P0.05),p65及磷酸化p65、磷酸化IκB-α蛋白表达明显降低(P0.05)。二、体外实验结果:1.对炎症因子影响:与Control组相比,LPS可刺激RAW 264.7巨噬细胞大量释放炎症因子NO、TNF-α与IL-6(P0.01);与LPS组相比,DEX低剂量+ESCIN可显著抑制NO、TNF-α与IL-6的产生(P0.01);与DEX低剂量组相比,DEX低剂量+ESCIN联合用药可增强对TNF-α及IL-6的抑制作用。2.对GR及其下游炎症通路影响:与Control组相比,给予LPS刺激可导致RAW 264.7巨噬细胞GR m RNA及蛋白表达明显降低(P0.05),磷酸化p65、磷酸化IκB-α蛋白水平明显升高(P0.05);与LPS组相比,DEX低剂量+ESCIN联合用药可显著提高GR m RNA及蛋白表达(P0.05),抑制磷酸化p65、磷酸化IκB-α蛋白表达(P0.05);但与单用DEX相比,联合用药GR m RNA及蛋白表达有一定提高;进一步阻断GR后,发现DEX低剂量+ESCIN联合用药对炎症通路磷酸化p65与磷酸化IκB-α蛋白的抑制作用明显减弱。结论:七叶皂苷能够增强低剂量糖皮质激素的抗关节炎作用,降低糖皮质激素的副作用,其作用机制可能与上调GR信号通路有关。
【学位授予单位】：烟台大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965

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本文编号：2647910