重组EGF在毕赤酵母中的组成型表达研究

发布时间：2020-05-04 09:13

【摘要】：表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)是由53个氨基酸组成的多肽,分子量为6054 Da。EGF作用广泛,其不仅能够促使表皮细胞增殖和分化,在角质细胞的生长和迁移方面也有促进作用,从而促进成纤维细胞和胚胎细胞的增殖。因此,EGF在伤口愈合、加速损伤修复以及器官形成中发挥了巨大的作用。它还广泛用于各种化妆品中,因为它可以促进透明质酸,糖蛋白等的合成和分泌,并活化皮肤的基底细胞。随着对EGF研究的不断深入,其特殊的生物学效应被不断挖掘,成为近几年来研究的热点。毕赤酵母表达系统是近年来使用最广泛的表达系统。该系统中表达载体都是整合载体,其中pGAP系列与其他整合载体相比优势更为突出。首先,使用pGAP系统发酵时不需要添加甲醇,一方面可以节省甲醇的运输成本,另一方面也可以避免甲醇因易燃易爆带来的潜在危险。其次,发酵过程中不需要更换碳源,可以减少杂菌的污染,此外,pGAP表达系统采用连续发酵的方式,发酵工艺简单而且周期短,大大提高了生产效率,更有利于工业化生产。本研究的目的是利用三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)的毕赤酵母表达系统组成型表达EGF,并对发酵工艺进行优化。本研究首先以毕赤酵母表达载体pGAPZαA为基础,根据酵母细胞密码子偏好性优化EGF基因序列并合成,在序列两端引入Xhol I和Eco R I位点,为方便纯化在目的基因前引入6×HIS,为实现蛋白的高效表达,选取融合标签-Asn-Gly,构建重组质粒pGAPZαA-6His-Asn-Gly-EGF。测序正确后,线性化电转至毕赤酵母感受态GS115。通过Zeocin抗性培养基和PCR鉴定筛选出成功整合到酵母基因组的工程菌,采用摇瓶培养,经Tricine-SDS-PAGE分析,获得了高表达重组蛋白的工程菌。本研究还对发酵工艺进行了探索,采用单因素实验方法优化发酵条件:最佳碳源,最佳pH值,最佳碳源浓度,最佳发酵温度,发酵时间和接种浓度。并采用Ni-Sepharose 6FF亲和层析柱纯化重组蛋白,用Bradford法检测EGF的分泌浓度。最后测定了经羟胺切割后的重组蛋白对Balb/c 3T3细胞的增殖活性。通过实验发现:高表达菌株在72 h具有最高的蛋白质表达,为0.05mg/mL。发酵条件经过优化得出:最佳碳源为甘油、其浓度为2.5%、发酵时间为72 h、接种量为2.0%、pH为6.0、温度为30℃。发酵液上清通过Ni-Sepharose 6FF柱成功获得了纯化的重组蛋白。生物活性实验结果表明,重组蛋白经羟胺切割后能够以剂量依赖的方式有效促进Balb/c 3T3细胞的增殖,具有良好的生物活性。
【图文】：

重组EGF在毕赤酵母中的组成型表达研究

EGF的结构

表达载体

图 1.2 pGAPZ 系列表达载体Sears 等[64]将 pGAP 基因亚克隆到载体 pIB1 中以获得 pIB2，并将β-葡糖醛酸糖苷酶基因克隆到 pIB2 中。经线性转化后，在毕赤酵母中β-葡糖醛酸糖苷酶得以成功表达。张平涛[65]也组成型表达羧肽酶 B（CPB），他是以 pIB2 为模板扩增pGAP 基因片段。在质粒 pPIC9K-proCPB 上取代 pAOX1 构建组成型表达载体pGAP9K-proCPB。pGAP表达系统可以使用多种碳源，例如油酸，甘油，葡萄糖和甲醇。但是哪种碳源是最佳的仍然有待研究。研究发现，当培养基中仅含有甲醇时，蛋白的表达最低[63]。一般情况下，毕赤酵母pGAP表达系统常用的碳源为葡萄糖和甘油，但在摇瓶表达时以葡萄糖为唯一碳源[66-67]，，而在高密度发酵水平则用甘油[68-69]。由于pGAP不需要甲醇诱导，所以不存在安全和环境污染的问题，并且发酵过程更安全，这为目的蛋白的工业化扩大生产提供了有利的条件。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R945

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