ATRA衍生物Fenretinide对肝癌增殖、迁移的影响及其机制的研究

发布时间：2020-05-04 11:00

【摘要】：研究背景肝癌是常见恶性肿瘤。2019年1月,国家癌症中心发布最新一期统计数据显示,原发性肝癌位于我国恶性肿瘤发病谱第四位,而病死率却居全国第二位。与全球恶性肿瘤新发病例和死亡病例比较,我国肝癌等消化道肿瘤占到全球一半。随着现代医学科学技术的发展,肝癌治疗取得了很大进步。但因肝癌早期临床症状不显著,70%~80%病人就诊时病情已为进展阶段。目前,以外科手术、肝动脉栓塞化疗、放疗以及联合多种治疗手段的综合治疗是我国专家推荐的治疗方案。因此,若能抑制肝癌细胞增殖和转移,将显著提高肿瘤治疗效果,改善病人预后。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)于上世纪八十年代已被我国科学家用于急性早幼粒白血病的治疗,取得了很好疗效,在九十年代被誉为国际抗癌药物三大发现之一,备受国内外专家关注。而ATRA在用于肝癌治疗时发现,要产生疗效,需要的药物浓度是白血病治疗的十倍。如此高的用药浓度不适合临床应用,其原因是高剂量ATRA的应用可引起维甲酸综合症。寻找低毒高效的维甲酸衍生物显得尤为重要。在ATRA基础上人工加上一个酰胺基团而成N-(4-羟基苯基)维生素甲酰胺(fenretinide)为乳腺癌化学预防的药物,其副作用较小。早期研究显示它具有预防和治疗肿瘤、促进肿瘤细胞凋亡的作用,近些年研究显示其具有预防肿瘤血管生成和抑制肿瘤转移的效应。本文着重研究fenretinide对肝癌细胞增殖、迁移的影响。肿瘤的转移与其运动性增强有密切关联,肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)的表达增加和激活是细胞运动的重要因素。Fenretinide抑制肿瘤细胞迁移的作用机制与降低细胞运动性是否有关?尚不明确。目前,fenretinide抑制肝癌细胞迁移及其相关机制报道较少。本课题探讨fenretinide对肝癌Hep G2和SMMC-7721细胞生物学行为的影响,是否能降低肝癌细胞的迁移,以及这种作用是否与MLCK有关,并通过动物体内实验进一步论证它的有效性和相关机制。为fenretinide更好的用于肝癌的临床治疗奠定理论基础。目的体外研究fenretinide对肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721增殖、平板克隆形成和迁移能力的影响,体内研究fenretinide对肝癌细胞系SMMC-7721成瘤影响,并初步探讨其作用机制。方法用不同浓度的fenretinide和前身药物ATRA分别处理肝癌Hep G2和SMMC-7721细胞,MTS法检测药物刺激后细胞的增殖能力;平板克隆实验检测药物作用后Hep G2和SMMC-7721细胞体外克隆形成能力;细胞划痕实验检测两种药物对Hep G2和SMMC-7721细胞迁移能力的影响。为进一步研究fenretinide和ATRA影响Hep G2、SMMC-7721细胞迁移的作用机制,Western blot检测MLCK、p38-MAPK信号通路蛋白、迁移相关蛋白等的表达。Hep G2和SMMC-7721细胞中分别和组合加入fenretinide、ATRA、SB203580、ML-7,以细胞划痕检测细胞迁移变化,Western blot检测相关蛋白表达变化。采用SMMC-7721细胞皮下移植裸小鼠获得肝癌移植瘤模型,用药后定期监测肿瘤体积和小鼠体重,观察药物对移植瘤增长的抑制作用,HE染色观察对移植瘤病理形态的影响,Masson染色观察对移植瘤纤维组织分布影响,免疫组化和Western blot检测对移植瘤MLCK、MLC和p38-MAPK磷酸化的影响。结果Fenretinide能抑制Hep G2和SMMC-7721细胞的增殖,在1μM~25μM浓度范围内,fenretinide对Hep G2细胞的生长抑制率为1.32%到95.13%;对SMMC-7721细胞生长抑制率为0.27%到78.36%,作用的量效关系明显。抑制作用的时效关系亦明显,fenretinide 15μM处理Hep G2细胞48 h抑制率接近50%,处理72 h则达到90%;15μM处理SMMC-7721细胞48 h抑制率接近30%,处理72h则达到85%。同时,fenretinide能显著抑制Hep G2和SMMC-7721细胞平板克隆形成和迁移能力。在相同药物浓度作用下,ATRA对细胞增殖、平板克隆和迁移抑制效应均弱于fenretinide。细胞蛋白水平检测显示fenretinide抑制了Hep G2细胞MLCK表达和MLC磷酸化,抑制了SMMC-7721细胞MLC磷酸化;并且改变了迁移相关蛋白E-cadherin和F-actin表达;在信号通路上,fenretinide激活了p38-MAPK通路。加入了p38-MAPK通路的抑制剂,显示SB203580会逆转fenretinide对Hep G2细胞迁移的抑制作用;蛋白水平检测显示,MLC磷酸化增加,迁移相关蛋白E-cadherin表达降低,F-actin表达增加,与fenretinide单独作用效应相反。进一步观察fenretinide是否通过降低MLCK活性减少Hep G2和SMMC-7721细胞的迁移,使用MLCK抑制剂ML-7,发现细胞的迁移能力明显受到抑制,ML-7联合fenretinide细胞迁移能力降低更显著;蛋白水平检测显示,MLC磷酸化降低,p38磷酸化增加,迁移相关蛋白E-cadherin表达增加,F-actin表达减少,与fenretinide单独作用效应相类同。体内裸小鼠移植瘤模型观察到fenretinide显著抑制SMMC-7721细胞移植瘤增殖,抑制能力随药物使用时间延长而加强,用药期间小鼠体重没有显著下降;移植瘤组织镜下可见细胞核排列相对规则,坏死较少见,纤维组织分布增加,MLCK磷酸化减少,p38-MAPK磷酸化增加。结论Fenretinide可以抑制Hep G2细胞和SMMC-7721细胞增殖、克隆形成和迁移能力;与ATRA比较,fenretinide更有效的抑制了Hep G2细胞和SMMC-7721细胞增殖、克隆形成和迁移作用;fenretinide激活p38-MAPK信号通路,改变迁移相关蛋白E-cadherin和F-actin表达,下调MLCK活性从而降低细胞运动性,抑制Hep G2和SMMC-7721细胞的迁移。Fenretinide有效抑制了肝癌移植瘤增殖,改善了肝癌组织形态紊乱状况,增加了纤维组织分布,作用可能与激活p38-MAPK通路,降低MLC磷酸化相关。
【图文】：

形态图,HepG2细胞,形态,细胞

图 5 fenretinide 改变 HepG2 细胞形态度 fenretinide 或 ATRA 作用于 HepG2 细胞 48 h，用 Leica DMI3000B 倒置显微态改变（放大 100 倍）Fig 5. The effect of fenretinide on the morphology of HepG2 cellsanges in cell morphology were observed when HepG2 cells were treated with trations of fenretinide or ATRA for 48 h, and cells were photographed using Leica DMcope (magnification, x100).enretinide 和 ATRA 作用 48 h，光镜下观察 SMMC-7721 细胞发现：对照和溶剂 DMSO 对照）如下图 6，细胞生长密集，光泽度好；5 μM 和inide 处理组（如下图 6）细胞密度均较对照组明显降低，生长稀疏，，细胞核出现肿胀、破裂等，细胞失去贴壁生长特性，高浓度组现时，细胞液颜色亦有改变，光镜下拍出的背景颜色区别较大。15 μM（如下图 6）细胞亦有减少，无堆叠生长，但形态改变不显著，5 μM（如下图 6）与对照组相比，形态和密度改变均不显著。

形态图,形态,迁移率,细胞

图 6 fenretinide 改变 SMMC-7721 细胞形态浓度 fenretinide 或 ATRA 作用于 SMMC-7721 细胞 48 h，用 Leica DMI3000B 倒置显细胞形态改变（放大 100 倍）Fig 6. The effect of fenretinide on the morphology of SMMC-7721 cellse changes in cell morphology were observed when SMMC-7721 cells were treated with diffcentrations of fenretinide or ATRA for 48 h, and cells were photographed using Leica DMI3croscope (magnification, x100).3 Fenretinide 抑制 HepG2、SMMC-7721 细胞迁移细胞划痕实验显示 fenretinide 以剂量依赖方式抑制 HepG2 细胞的迁移，如 7。24 h 迁移率分别为：5 μM，0.22±0.04，10 μM，0.19±0.05；48 h 迁移率分：5 μM，0.51±0.07，10 μM，0.32±0.01。而细胞对照组的迁移率 24 h 是 0.45±0 h 是 0.74±0.05。统计结果显示 fenretinide 在 24 h 和 48 h 可显著抑制 HepG的迁移(p㩳0.05)，，如下图 7B。ATRA 仅高浓度 10 μM 组有抑制 HepG2 细胞
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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