juanlimycin类化合物的发现与两株稀有放线菌的基因组挖掘

发布时间：2020-05-06 10:14

【摘要】：微生物特别是放线菌是天然产物药物的主要来源,至今已从放线菌中分离得到超过10000种生物活性物质。上世纪80年代后对放线菌菌株的反复发现和分离,致使从放线菌中分离得到的重复化合物越来越多,研究人员一度以为微生物天然产物资源已经枯竭。然而,基因组测序结果显示,许多微生物含有大量的可能编码新颖次级代谢产物的基因簇,只是受传统挖掘方法的限制不能被完全发掘,基于此种背景,各种基因组挖掘方法应运而生,并在天然产物发现领域发挥着越来越重要的作用。本论文尝试对三株AHBA合酶基因阳性菌包括一株链霉菌(LC6)和两株稀有放线菌(疣孢菌NS0172和小单孢菌FXYA29)进行基因组挖掘,从中发现新结构或活性天然产物。Juanlimycin A和B是本实验室前期从链霉菌LC6中分离得到的新颖二聚化五酮安莎霉素,为获得更多的juanlimycin类化合物并开展其生物合成研究,我们通过敲除竞争代谢产物十一烷基因灵菌红素基因簇Red和过表达途径专一性正调控基因尝试提高juanlimycin类化合物的产量与类型。本论文使用SFM培养基对LC6-deRED-SARP突变株进行了 95 L大规模发酵,通过HPLC指导的追踪分离,从中分离鉴定了 A、F、H和I四个化合物,其中A和I为juanlimycin类新化合物。我们还尝试通过调控基因过表达和启动子工程对疣孢菌NS0172和小单孢菌FXY A29进行沉默基因簇激活并分离鉴定其次级代谢产物。在前期遗传操作方法的基础上,我们进一步通过摸索孢子萌发条件和孢子热激条件显著提高了接合转移效率,为后续工作奠定了良好的基础。在疣孢菌NS0172中,通过两轮启动子替换,我们部分“激活”了Ⅱ型PKS-NRPS杂合基因簇NS0172-GC2,从突变株NS0172-GC2-1中分离得到两个化合物Al,A2,其中Al经核磁鉴定为邻-(4-羧基-1-丁烯基)苯丙酸,A2为邻-5-羟基-6-羧基已烯基苯丙酸。Al和A2推测由Ⅱ型聚酮样亚基因簇orf50-59负责合成,但还需要进一步的基因敲除实验进行证实或证伪。此外,通过表达SARP家族调控基因orf39我们获得了突变株0172-GC5-SARP,该突变株提取物呈现墨绿色,与野生型相比存在多个差异峰。突变株发酵时培养基没有颜色变化,但产生大量黑色油状孢子,我们推测提取物中墨绿色成份是某种“孢子色素”。我们使用YMG培养基对该突变株进行5L发酵和目标化合物的分离,但墨绿色成份由于难溶于常用有机溶液,未能获得纯化与结构鉴定;另外275 nm下出现几个差异峰化合物量较少,也未能鉴定结构,需要进一步扩大发酵规模或优化发酵条件后再进行分离。在小单孢菌FXY A29中,我们尝试对GCl(PKS-NRPS-Lantibiotic杂合基因簇)、GC9(Type ⅡPKS基因簇)和GC15(trans-ATPKS-NRPS杂合基因簇)进行了激活。从双向启动子替换突变株A29-GC1中我们分离获得了化合物B1和B2,令人意外的是,B1与NS0172-GC2-1突变株中获得的A1结构完全相同,尽管在A29的基因组中存在2条Ⅱ型聚酮途径,但与NS00172-GC2的Ⅱ型聚酮样亚基因簇存在较大差异。在已经排除发酵过程污染的情况下,我们推测可能原因有:1)由于基因组序列不完整造成某些序列丢失;2)A29中采用不同的途径合成该类化合物。使用与A29-GCl相同的启动子替换策略,我们对GC15进行两轮替换分别获得了 A29-GC15-1和A29-GC15-2突变株,其中A29-GC15-2突变株与野生型相比有两个明显的差异峰B3和B4,由于分离过程中发生了转化或降解,这两个化合物未能获得鉴定,需要重新发酵并改进分离方法,尝试在低温或避光条件下进行分离。综上所述,在对两株稀有放线菌进行接合转移条件优化的基础上,我们使用多种策略对上述三株放线菌中多条次级代谢途径进行了产物挖掘,鉴定了2种类型至少4个新化合物。挖掘工作总体存在工作量大、成功率低等问题。因此,对于遗传操作困难且生长缓慢的稀有放线菌或其它微生物,启动子替换与调控基因过表达这两种常用挖掘策略可能并不是非常好的选择,而绕过原始菌遗传操作的“通过合成生物学策略进行体外途径组装并在合适的放线菌底盘中进行异源表达”或者仅需要简单遗传操作的“培养基优化与双报告基因选择”等方法可能更适用于(稀有)放线菌新天然产物的的挖掘。
【图文】：

Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ逦Ｒｏｓａｒａｍｉｃｉｎ逡逑图１．２稀有放线菌中分离得到的化合物逡逑２．聚酮类与非核糖体肽类化合物逡逑由聚酮合酶（ＰＫＳ）催化合成的聚酮类化合物（ＰＫｓ），是天然产物中的一－大逡逑家族，许多抗生素如红霉素、阿维菌素、四环素等都是聚酮类抗生素６。目前己逡逑知的ＰＫＳ可以分为三大类：丨型、丨丨型和丨丨丨型。逡逑Ｉ型ＰＫＳ是一个巨型多功能酶复合体，可分为迭代型（丨ｔｅｒａｔｉｖｅ）与模块型逡逑（Ｍｏｄｕｌｅ）。ＵｅｒａｔｉｖｅＰＫＳ邋（ｉＰＫＳ）存在于真菌和细菌中，催化合成芳香聚酮类，，逡逑烯：炔类等化合物。Ｍｏｄｕｌｅ邋ＰＫＳ邋（ｍｏｄＰＫＳ）则主要存在于细菌中，催化合成大逡逑环内酯类，多烯类．聚醚类等化合物１８。本论文主要对ｍｏｄＰＫＳ进行研[偂＃恚铮洌校耍渝义希插义

本文编号：2651111