临床生物样本前处理方法的研究及临床应用意义

发布时间：2020-05-05 20:16

【摘要】：临床治疗药物监测(TDM),作为实现患者个体化治疗的重要手段之一,其在临床上的普及很好地保障了临床患者用药的安全性及有效性,有力地支持了精准医疗工作的开展。其中,对临床生物样本进行分析是实现TDM的重要手段之一。无论是临床生物样本还是普通健康受试者生物样本,其中都含有大量的内源性大分子,使得分析结果易受基质效应的影响,因此在分析前,往往需要对样本进行适当地前处理,将待测组份从生物样品基质中分离出来,以降低基质效应的影响。目前常用的生物样本前处理方法主要有蛋白沉淀法(PPT)、液液萃取法(LLE)、固相萃取法(SPE)等,这些方法往往是使用健康志愿者的血浆进行方法学验证,但是,临床生物样本的状态与健康志愿者明显不同,健康志愿者的生物样本状态相对稳定,所造成的基质效应变异度小,而临床患者的生物样本状态往往因受疾病状态的影响而变现出很大的个体差异,导致基质效应差别显著,因此,临床样本分析结果的准确性不易得到保障。有研究表明,临床患者血液样本的粘度、蛋白浓度、胶体渗透压等都极易受到疾病状态的影响,表现出很大的变异性,而蛋白沉淀量、萃取效率等极易受到这些因素等影响,因此,在使用PPT、LLE或SPE处理不同临床患者的血样时,即便是加入的沉淀剂或萃取剂的量完全相同,也很容易导致待测物的回收率不同,从而影响分析结果的准确性。此外,传统的生物样本前处理方法检测指标单一,通常仅能用于总药物浓度(Ct)或游离药物浓度(Cf)的检测,而Ct或Cf易受到采样时间、用药时长、进食等因素的影响。在普通的生物样本研究中,这些因素都会被严格地控制,此时,测定的Ct或Cf可以较为准确地反应机体整体的用药情况。但是,在对临床患者进行研究或日常监测时,患者的采样点、进食时间、食物种类等,都不容易像非临床生物样本研究一样被严格控制,因此,所测定得Ct或Cf可能很难真实地反应体内药物水平。同时传统前处理方法还存在着操作复杂、耗时长等问题,对结果的准确性、分析效率造成影响。由于传统样品前处理方法并未考虑到临床样本的特殊性,分析结果往往给临床研究及日常TDM带来了许多困惑,甚至影响到患者的个体化治疗效果。因此,建立简便、准确、适当且免于疾病状态干扰的临床生物样本前处理方法,是保障测定结果的准确性、测定指标的合理性、提高方法的普及性的关键因素,可为临床生物样本日常检测以及药物药效学关系的研究提供可靠地分析平台,更好地保证临床患者用药安全有效,提高治疗效果,降低毒副反应。第一部分集血样采集与处理于一体的新型生物样品前处理方法目的:将封闭技术与中空纤维超滤法(FE-HFCF-UF)相结合,建立一个简单、有效、免处理的生物样品前处理方法,用于保障临床生物样本分析结果的真实性,同时提高了分析过程的生物安全性。方法:以阿德福韦和替诺福韦为模型药物,将封闭技术与直接进样技术相结合,建立一个全封闭的中空纤维超滤技术。在负压的作用下,约0.6 m L的全血样品通过采血针进入到超滤管中,采集完成后,轻轻震荡超滤管,使管壁及中空纤维外壁上的抗凝剂溶解至全血中,得到抗凝血样;然后,在25°C下,离心转速为3500 r/min,离心20 min,从中空纤维内腔约取出50μL超滤液,衍生后取20μL衍生液注入色谱系统进行分析。色谱条件:采用Phenomenex C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm);阿德福韦和替诺福韦的流动相分别为10 m M磷酸二氢钾(内含2 m M氢氧化四丁铵)-乙腈(88:12,v/v)和10 m M磷酸二氢钾(内含2 m M氢氧化四丁铵)-乙腈(90:10,v/v);流速为1.0 m L/min;柱温为30°C;阿德福韦的激发波长为309 nm,发射波长为425 nm,替诺福韦的激发波长为254 nm,发射波长为425 nm.结果:测定结果显示FE-HFCF-UF方法具有良好的精密度、灵敏度和回收率。日间和日内精密度的RSD值均小于4.1%,绝对回收率可达100%。结论:该方法操作简便,集血样采集与样品前处理于一体,仅需一步简单离心,即可从全血中分离得到只含有小分子的超滤液,几乎免除了人工操作,并且可以使用标准溶液代替加标血样去制备标准曲线,免除了血浆状态对结果的影响,保证了分析过程的简便性、准确性和灵敏度。此外,简便的操作及封闭系统都提高了分析过程的安全性。由于新方法的种种优良特性,有望为生物样品分析提供了一个简便、有效的分析平台,并为进一步提高分析方法的生物安全提供了一个新的思路。第二部分氨茶碱蛋白结合率的测定以及其与药物药效学关系的研究目的:以中空纤维超滤(HFCF-UF)为基础方法,测定临床患者中氨茶碱(AYP)的蛋白结合率(PPB),并结合临床患者信息探讨氨茶碱(AYP)PPB的影响因素,为合理化用药提供参考依据。方法:采用HFCF-UF方法,测定氨茶碱的游离浓度(Cf),再通过加入释放剂的方法,使与蛋白相结合的氨茶碱游离出来,再次使用HFCF-UF法,测定氨茶碱总浓度(Ct),通过公式计算,得出氨茶碱PPB。色谱条件:采用Diamonsil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),流动相为10mmol/L乙酸铵缓冲溶液与甲醇以80:20的比例混合,流速1.0 m L/min,检测波长为275 nm,进样量为20μL。结果:本研究对来自于80位患者的80份临床样本进行了PPB测定,结果显示PPB范围为9.8%-98.1%。经过数据分析发现,患者的性别、生理状况、疾病状态、合并用药情况对AYP的PPB有影响作用。结论:患者群体中的氨茶碱PPB存在着极大的个体间差异,因此,有必要对使用AYP的临床患者进行PPB监测,完善AYP的用药信息,提高患者临床用药的安全性和有效性。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

【参考文献】