醋氨酚诱导小鼠急性肝损伤中JNK信号通路与GSTA1的作用研究

发布时间：2020-05-05 18:05

【摘要】：醋氨酚(又称对乙酰氨基酚,acetaminophen,APAP)是一种解热镇痛药,存在于市面上多种复方感冒制剂中,过量使用时,会产生严重急性肝脏毒性,导致肝细胞坏死、肝衰竭甚至造成死亡。APAP诱导的肝损伤模型是研究药物性肝损伤的经典模型。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是丝裂原活化蛋白激酶家族的一个成员,在细胞受到环境或细胞因子刺激时会被激活,并参与调控细胞炎症、凋亡、生长、分化等过程。过量醋氨酚导致的药物性肝损伤中存在氧化应激,其可能与JNK的激活相关。谷胱甘肽S转移酶A1(GSTA1)是Ⅱ相代谢解毒酶之一,催化醋氨酚的有毒代谢产物N-乙酰对苯亚胺醌与谷胱甘肽结合,提高机体抗氧化水平和解毒功能。本研究在APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型的基础上,通过给予JNK选择性抑制剂SP600125,确定JNK信号通路和GSTA1在APAP诱导的肝损伤中的作用,为进一步研究药物性肝损伤机制奠定基础。本试验采用不同剂量APAP给予小鼠,通过检测血清转氨酶(ALT、AST)活性,确定可造成不同程度肝损伤的APAP剂量。在此模型基础上通过检测血清转氨酶活性筛选JNK抑制剂SP600125的最适作用剂量。随后进行JNK信号通路和GSTA1在肝损伤中的作用研究。试验分为五组:对照组、低剂量APAP组(150 mg·kg~(-1) APAP)、高剂量APAP组(175mg·kg~(-1)APAP)、低剂量APAP+SP组(150 mg·kg~(-1) APAP+2 mg·kg~(-1) SP600125)、高剂量APAP+SP组(175 mg·kg~(-1) APAP+2 mg·kg~(-1) SP600125),应用试剂盒检测血清ALT、AST和肝组织指标(MDA、SOD、GSH、GSH-Px)水平;应用ELISA试剂盒检测小鼠血清及肝组织中GSTA1的含量;应用HE染色法对肝脏进行病理组织学检查;采用Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡;采用Western blot方法测定肝组织中p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun、p-c-Fos、c-Fos、p-ASK1、ASK1、p-MKK4、MKK4及GSTA1蛋白的相对表达量。通过以上研究,明确在APAP诱导的小鼠急性肝损伤中JNK信号通路是否被激活以及JNK、GSTA1与药物性肝损伤之间的关系。研究结果表明:(1)应用梯度剂量APAP给予小鼠灌胃12 h可对其造成不同程度的肝损伤。当给药剂量为150 mg·kg~(-1)时,血清转氨酶活性显著升高(p0.05);当给药剂量为175 mg·kg~(-1)时,血清转氨酶活性极显著升高(p0.01)。最终确定以150 mg·kg~(-1)、175 mg·kg~(-1)作为可以造成不同程度肝损伤的醋氨酚剂量。(2)在肝损伤模型的基础上,筛选出JNK抑制剂SP600125的最适作用剂量为2 mg·kg~(-1)。(3)JNK抑制剂作用小鼠后,与高剂量APAP组相比,高剂量APAP+SP组血清转氨酶活性极显著下降(p0.01),肝组织中丙二醛含量显著降低(p0.05),超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽含量、谷胱甘肽过氧化物酶活性极显著升高(p0.01),血清和肝脏中GSTA1含量极显著变化(p0.01);与低剂量APAP组相比,低剂量APAP+SP组肝组织中丙二醛含量显著降低(p0.05),超氧化物歧化酶活性显著升高(p0.05),谷胱甘肽含量、谷胱甘肽过氧化物酶活性极显著升高(p0.01),血清和肝脏中GSTA1含量极显著变化(p0.01)。病理组织学检查显示低剂量APAP组有少量出血点,肝索轻微紊乱,高剂量APAP组肝细胞索消失,大量炎性细胞浸润,淤血严重,细胞碎裂;低剂量APAP+SP组出血点明显减少;高剂量APAP+SP组无出血点,炎性细胞数量骤减,肝索排列规则。Hoechst 33258检测凋亡结果表明,APAP组随着剂量的增加,细胞发生凋亡的趋势越明显,细胞核固缩;给予JNK抑制剂后,细胞凋亡现象明显减少。以上结果表明JNK抑制剂减轻了APAP诱导的肝组织损伤和肝细胞凋亡。(4)JNK信号通路上下游蛋白的表达结果表明,不同剂量APAP组中p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos、p-MKK4/MKK4、p-ASK1/ASK1比值均高于对照组,差异极显著(p0.01);高剂量APAP+SP组p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-MKK4/MKK4、p-ASK1/ASK1比值低于高剂量APAP组;JNK抑制剂没有降低p-c-Fos/c-Fos比值。说明在小鼠不同程度肝损伤中,JNK信号通路被激活,JNK上下游蛋白磷酸化水平增加;给予JNK抑制剂后,JNK、c-Jun、ASK1、MKK4磷酸化水平下降,但c-Fos磷酸化水平没有变化。表明JNK信号通路的激活和JNK上下游蛋白的磷酸化参与了APAP所致的肝损伤,与肝损伤程度呈正相关。(5)GSTA1蛋白表达的结果显示,不同剂量APAP组中GSTA1相对表达量极显著低于对照组(p0.01);低剂量APAP+SP组GSTA1相对表达量显著高于低剂量APAP组(p0.05);高剂量APAP+SP组GSTA1相对表达量极显著高于高剂量APAP组(p0.01)。说明APAP诱导的肝损伤中GSTA1表达量减少,给予JNK抑制剂后表达量增多,表明肝损伤发生时肝脏GSTA1的表达量降低,肝脏抵抗损伤的能力下降,JNK抑制剂通过抑制JNK的激活保护肝脏,GSTA1表达量上升,肝脏抵抗损伤的能力增强。本研究成功复制APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型,确定SP600125的最适作用剂量,在APAP诱导的急性肝损伤中,JNK信号通路被激活,应用JNK抑制剂可以降低JNK信号通路相关蛋白的磷酸化,增加肝脏中GSTA1的表达量,减轻APAP引起的肝损伤和凋亡。明确JNK信号通路在APAP诱导的肝损伤中的作用,该通路可能通过调控GSTA1的表达来抵抗过氧化损伤,但其机制仍需进一步深入研究。
【图文】：

亚型,病理状态,凋亡,信号通路

图 1-1 MAPK 信号传导途径[57]Fig. 1-1 MAKP signaling transduction pathways JNK 信号通路相关研究NK 在细胞受到环境或细胞因子刺激（包括渗透性休克、发热、缺氧、DNA 损伤度重金属）时会被活化[58, 59]。研究表明，大部分生物过程（如细胞分化、凋亡都与 JNK 激活相关，因此 JNK 被看做是生理状态与病理状态的临界点[60]。起初线菌酮处理的大鼠肝脏中分离出来的 54 kDa MAPK 蛋白[61]，JNK1 和 JNK2 在织器官均有表达，而 JNK3 仅选择性的存在于大脑、心脏和睾丸中[62]。这三个达 10 个亚型，包括 4 个 JNK1 亚型、4 个 JNK2 亚型和 2 个 JNK3 亚型[63]。化应激可以导致 MAP3K 的激活，其中凋亡信号调节激酶 1（ASK1）参与了 JNK1位于 JNK信号通路的上游，通过激活 MKK-4/7激活 JNK。MKK4（MAP kinase MKK7（MAP kinase kinases 4）可以通过在 Thr183 和 Tyr185 的双重磷酸化对。在 JNK 信号级联中，ASK1 可以激活 MAP2K（如 MKK4 和 MKK7），它们可游激酶 JNK。实验证明，ASK1 过表达诱导凋亡而 ASK1 沉默表达抑制凋亡[64] 在应激或细胞因子导致的凋亡中起调节作用。正常生理状态下，ASK1 与硫氧还复合物，但是在病理状态时，，在炎症因子或氧化应激存在的条件下，该复合物会

小鼠,剂量,对照组,和图

与分析酚诱导小鼠急性药物性肝损伤模型的复制P 诱导小鼠急性药物性肝损伤模型复制的试验中，各剂量组小鼠血化如图 3-1 和图 3-2 所示。结果显示，与对照组相比，150 mg·kg-1均显著升高（p<0.05），175 mg·kg-1和 200 mg·kg-1APAP 组 ALT 和（p<0.01）。因此选择 150 mg·kg-1和 175 mg·kg-1这两个剂量用于后续
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965

【参考文献】