创新霉素与色氨酰-tRNA合成酶复合物的结构研究

发布时间：2020-05-05 11:57

【摘要】：目的高效表达嗜热脂肪芽胞杆菌色氨酰-tRNA合成酶(BsTrpRS),获得创新霉素与BsTrpRS的复合物晶体,并利用X-ray进行晶体衍射数据收集和晶体结构程序解析复合物的晶体结构,结合分子动力学模拟从分子水平揭示药物与受体相互作用的机制,为药物的设计与优化提供理论基础。方法1.构建含有BsTrpRS蛋白目的基因的表达载体,利用大肠杆菌表达系统获得TrpRS蛋白的可溶性表达。2.采用亲和层析色谱、离子交换色谱和分子排阻色谱纯化目的蛋白,以期获得纯度在90%以上的BsTrpRS,后通过表面等离子共振法(SPR)和等温滴定量热法(ITC)来检测BsTrpRS的活性。3.选用气相扩散悬滴法,通过优化结晶条件(包括蛋白浓度、沉淀剂浓度、温度和pH等)获得可进行X-ray衍射的高质量晶体,获取衍射数据。4.采用共结晶法获取BsTrpRS与创新霉素复合物的晶体。5.将得到的复合物晶体进行X-ray衍射并收集数据,解析复合物晶体结构,并结合分子动力学模拟和定点突变验证,揭示创新霉素在BsTrpRS靶点的作用机制。结果1.运用分子生物学方法成功构建含BsTrpRS基因的重组质粒,并通过优化得到BsTrpRS蛋白高表达菌株BL21(DE3)。2.运用亲和层析、离子交换色谱和分子排阻色谱等蛋白纯化下游技术,获得高纯度BsTrpRS蛋白。3.通过SPR和ITC技术,验证了BsTrpRS的活性,并确证了创新霉素与BsTrpRS之间具有高亲和力。4.通过晶体筛选,获得了X-ray衍射分辨率为2.06?的创新霉素*BsTrpRS二元复合物晶体和2.16?的创新霉素*ATP*BsTrpRS三元复合物晶体,并解析得到各自的复合物三维结构,结合分子动力学模拟和定点突变验证,从分子水平揭示了创新霉素与BsTrpRS之间的相互作用机制。结论本研究从分子水平阐明了创新霉素与其靶点BsTrpRS相互作用的机制,为创新霉素与BsTrpRS的结合提供了确切的分子结构模型,为后期筛选、设计药效更好的创新霉素药物打下理论基础。图34幅;表13个;参111篇。
【图文】：

重组质粒,琼脂糖凝胶

华北理工大学硕士学位论文大小选择所需浓度的琼脂糖凝胶（如 0.9%，称取TAE），置于微波炉中加热使琼脂糖完全溶解。摇匀后，倒入合适的模具中，检查有无气泡，插上完全凝固，拔出梳子，将琼脂糖凝胶放入电泳槽中液，浸过胶表面。与上样缓冲液混合，用移液枪将样品加入样品孔，。选择合适的电压，接通电源。待指示剂迁移至合凝胶在凝胶成像仪上观察电泳结果，，并拍照保存。RS 重组质粒构建sTrpRS 与质粒载体 pET-21a(+)分别用 Nde I 和 Xh组质粒 pET-21a-BsTrpRS，如图 1 所示。

标准曲线,标准曲线,蛋白,标准蛋白

配制： 5×Coomassie 浓缩液稀释为 1×染液，后用普通滤纸将沉淀，4℃保存。蛋白梯度：mg mL-1的 BSA 标准蛋白溶液与 5 μL 稀释液（Tri-HCl/PBL 2 mg mL-1的 BSA 标准蛋白溶液，取 5 μL 依次倍比稀白溶液 4 mg mL-1、2 mg mL-1、1 mg mL-1、0.5 mg mLg mL-1、0.0625 mg mL-1、0.03125 mg mL-1、0.015625 mg 标准曲线：到低依次取 3 μL BSA 标准蛋白溶液分别与 300 μL 上述在 OD450 和 OD595 处读取吸光度值。以 BSA 标准蛋95/OD450 为纵坐标 Y，利用 Excel 软件制作蛋白标准
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R91

【参考文献】