干预肿瘤分泌型GRP78的药物筛选及其作用机制研究

发布时间：2020-05-06 22:24

【摘要】：葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在多种肿瘤细胞中特异性高表达,高表达的GRP78在肿瘤细胞中具有定位多样性,且具有多样化的促癌效应。值得注意的是,GRP78不但可以定位于胞内,还可通过外泌体途径被肿瘤细胞分泌到肿瘤微环境中,从而发挥促肿瘤作用。因此寻找能够阻断GRP78分泌的小分子抑制剂,将提高化疗药物的抗癌效率,为癌症治疗打开新的突破口。为了发现GRP78分泌的潜在抑制剂,我们将从以下几个方面进行研究:1.通过检测多种结肠癌细胞系及正常肠上皮细胞的培养基中GRP78的含量,发现结肠癌细胞能特异性分泌GRP78,且结肠癌细胞系中DLD1分泌的GRP78含量较高,而HCT-116分泌的GRP78相对较少。而将GRP78的K633位点突变为谷氨酰胺后,肠癌细胞的GRP78分泌量明显降低,表明K633位点对GRP78的分泌具有重要作用。此外,通过细胞共培养模型发现,GRP78的分泌能促进HUVEC细胞的血管生成能力。表明分泌型GRP78在微环境中能发挥促肿瘤相关血管生成的作用。2.运用虚拟筛选及分子对接等技术在虚拟平台创建多种小分子的药物结构与GRP78蛋白结构间三维水平的相互作用模型,从而在51种中药分子中发现了5种与GRP78相互作用力较强且结合方式多样化的小分子。这5种中药小分子分别是:丹酚酸A(Salvianolic acid A,SAA)、柚皮苷(Naringin)、桔梗皂苷D(Platycodin D)、地奥司明(Diosmin)和异牡荆素(Isovitexin)。3.通过使用蛋白免疫印迹在细胞水平的验证,发现丹酚酸A能够有效抑制GRP78的分泌。此外,小分子与蛋白相互作用的研究揭示SAA可与GRP78的633位的赖氨酸残基(K633)发生相互作用,且具有极强的亲和力,从而发挥其抑制GRP78分泌的效应。研究还发现丹酚酸A能够通过阻断GRP78的分泌干预肿瘤相关血管生成。4.研究发现SAA-GRP78复合物的形成,能够促进细胞溶质中GRP78分选进入溶酶体降解途径而不是被外泌体分泌。体内实验结果显示,丹酚酸A能降低瘤体内VEGF表达量,抑制瘤块生长,即丹酚酸A通过改善肿瘤微环境发挥抑癌作用。
【图文】：

旁分泌,癌细胞,肿瘤,亚细胞器

Figure 1.1 The tumor microenvironment at a glance1.1.2 肿瘤微环境在肿瘤发展中的作用生物体内细胞与其微环境间的通讯机制对维持组织稳态是至关重要的。此外，在实体瘤内肿瘤细胞和相关基质之间的相互作用影响着疾病发生、进展和患者预后的强大网络关系[19]。例如，在癌症发展进程中，癌细胞必须与携带胶原，透明质酸（HA）和肿瘤促进因子的ECM形成附着。肿瘤细胞和TME间的作用方式主要分为两大类：接触依赖性机制和非接触依赖性机制，在非接触依赖性机制中，可溶性分子如生长因子，趋化因子和细胞因子和可溶性亚细胞器，包括微泡和外泌体，它们相互作用并通过旁分泌机制激活。肿瘤微环境通过连续的旁分泌通讯和基质细胞与癌细胞同时进入活化状态，形成动态信号回路，其中多种分子协同促进肿瘤扩张和侵袭，最终导致恶性进程[20, 21]。在肿瘤免疫逃逸方面，肿瘤微环境中的免疫细胞不仅失去了抗肿瘤效应，反而还被用于促进肿瘤生长。例如，存在于肿瘤微环境中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞，它被重新编程通过释放抑制性细胞因子，如 IL-10、前列腺素或活性氧（ROS）

肿瘤相关

图 1.2 肿瘤相关管成式[35]Figure 1.2 The way of tumor angiogenesis原发性癌很少导致患者死亡（肺癌和肝癌除外），而大多数癌相关死亡是由癌细胞转移引起的并发症所导致。对于大多数恶性肿瘤，转移的重要步骤之一是癌细胞必须形成新的血管系统。通常，瘤块越大，瘤体内的血管密度越高，肿瘤细胞逃逸几率越大。对于离开血液循环的大多数单个癌细胞要么凋亡，要么被免疫细胞消除，要么只保持休眠状态不实现继发性肿瘤的形成[38]。论证肿瘤相关血管生成和肿瘤转移的有力证据之一，是肿瘤微血管密度与几乎所有形式的恶性肿瘤中转移潜能的增加和存活率差相关。此外，血管生成对于癌细胞肺转移的形成至关重要。一些研究表明，骨髓来源的 EPC 有助于肿瘤转移性生长的早期血管生成[39]，而另一些研究则认为正常血管的合并是转移性血管形成的机制。此外，周细胞也在肿瘤转移中发挥作用，，它有助于控制毛细血管腔的通畅性，MMP9敲除小鼠缺乏周细胞，血管形态塌陷，转移减少。临床前试验中的抗血管生成疗法可
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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