基于光控基因表达技术的纳米递药系统构建及治疗黑色素瘤的研究
发布时间：2020-05-06 18:33
【摘要】：目前,全球黑色素瘤发病率逐渐上升,其生存率低、复发转移率高,极大威胁了患者的生命。对此,本课题采用光控基因表达技术以及肿瘤免疫的方法来治疗黑色素瘤。本文拟采用维生素E琥珀酸酯(VES)和聚乙烯亚胺(PEI),通过引入二硫键(-ss-)合成两亲性VES-ss-PEI聚合物,在水中自组装制备阳离子胶束,采用静电吸附作用包载抗原卵清蛋白或白喉毒素基因等药物,载药胶束仍呈正电性,通过静电相互作用力包被由聚乙二醇(PEG)连有Arg-Gly-Asp(RGD)三肽的透明质酸(HA)外壳HA-PEG-RGD,构建纳米递药系统。采用光控基因表达技术,白喉毒素pDNA在肿瘤细胞内产生白喉毒素,来杀灭肿瘤细胞;采用卵清蛋白(OVA)标记肿瘤细胞并产生抗原性,利用激活的特异性免疫细胞来抑制肿瘤生长,通过体内外实验研究黑色素瘤的抑制效果,为治疗黑色素瘤的研究奠定了实验基础和理论依据。首先合成了载体材料VES-ss-PEI与HA-PEG-RGD,通过核磁氢谱、核磁碳谱、红外光谱等手段确定材料的成功合成。采用超声法制备阳离子纳米胶束VES-ss-PEI,其粒径范围在50.8～70.4 nm,电位在48.8～53.4 mV之间。进一步在表面包被多功能外壳,制备得到VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD纳米胶束,其粒径范围在64.4～82.8 nm,电位在-16.7～-41.2 mV之间。制备的纳米胶束球形完整,粒径均一,具有优良的体内外稳定性。采用近红外染料IR-775考察纳米胶束在体内的分布特性。结果表明,与游离IR-775组相比,IR-775@VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD纳米胶束组的血中AUC0-2h增加4.4倍,肝脏和脾脏中AUC0-24 h分别增加3.3倍和1.5倍,活体成像实验表明该纳米胶束具有肿瘤靶向能力的同时,也会富集于肝脏和脾脏中。利用静电吸附作用包载卵清蛋白(OVA),采用超声法制备得到了粒径为55.9 nm的OVA@VES-g-PEI纳米胶束,OVA载药率为28.8%,通过静电吸附作用包被多功能外壳制得OVA@mPEG-g-HA/VES-g-PEI纳米胶束,其粒径增大到72.1 nm。OVA@mPEG-g-HA/VES-g-PEI纳米胶束在pH 7.4的PBS释放介质中具有一定的缓释效果。与游离OVA组相比,OVA@mPEG-g-HA/VES-g-PEI纳米胶束组能显著提高细胞对蛋白的摄取能力(p0.01),能够帮助蛋白从溶酶体中逃逸,逃逸的蛋白能在内质网中加工成短肽并形成MHC I-OVA257-264复合物标记在肿瘤细胞表面,同时能显著增加树突细胞表面标志物CD80和CD86的表达量,表明mPEG-g-HA/OVA@VES-g-PEI纳米胶束能有效刺激树突细胞并使其成熟,具有明显的抑瘤效果。考察不同N/P条件下载基因纳米胶束的粒径、电位、包载基因能力、稳定性确定最佳N/P为10,并制备得到pDNA@VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD纳米胶束。该纳米胶束能提升基因稳定性,在PBS溶液和含有10 mM的谷胱甘肽还原酶(GSH)的PBS溶液中,72 h时基因累计释放率分别为14.3%和62.0%,表明其具有还原敏感性。细胞摄取和转染实验表明,包载光控绿色荧光蛋白基因的VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD纳米胶束能显著提高基因的摄取和转染能力,通过控制蓝光照射强度,能调控绿色荧光蛋白在细胞内的表达量。体外MTT实验、3D肿瘤球实验、细胞划痕实验、细胞凋亡实验表明,包载光控白喉毒素基因的VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD纳米胶束经过蓝光照射后具有明显的肿瘤细胞抑制能力。小鼠抑瘤实验结果表明,经过光控基因表达系统治疗的荷瘤小鼠,与肿瘤模型组相比,包载光控白喉毒素基因的VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD纳米胶束组的肿瘤抑制率为79.2%,荷瘤小鼠的生存率从10%提高到了100%,显示出其具有显著的肿瘤抑制能力。肿瘤组织切片染色实验表明,肿瘤细胞有明显损伤,肿瘤新生血管细胞数量明显减少,表明包载光控白喉毒素基因的VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD纳米胶束在经过蓝光照射治疗后能够抑制肿瘤的生长,组织脏器切片染色实验表明,蓝光未照射的组织无明显毒副作用。初步考察了光控基因表达系统联合OVA免疫的抗黑色素瘤效果,为光控基因表达免疫白喉毒素与免疫治疗联合治疗黑色素瘤的治疗新策略提供理论依据。
【图文】：
通过双功能聚乙二醇（ＰＥＧ）、透明质酸（ＨＡ）与Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ三肽（ＲＧＤ）逡逑合成ＨＡ－ＰＥＧ－ＲＧＤ，通过静电相互作用力包被在载药胶束表面构建免疫纳米递药系统逡逑（见图１．５）。利用光控基因表达系统可控地在肿瘤细胞内表达白喉毒素的Ａ片段（ＤＴＡ）逡逑蛋白催化ＮＡＤ＋上的ＡＤＰ核糖基向ＥＦ－２转移，，进而抑制细胞的胞内蛋白质合成而表现逡逑毒性来杀伤肿瘤细胞及肿瘤新生血管细胞（见阁１．６途径①）。由白喉毒素杀死的肿瘤细逡逑胞释放出癌症相关抗原经树突细胞呈递后激活Ｔ细胞，从而X椉又琢銮颍韵赴氖义狭浚迹保锻揪盯郏Ｍ崩寐亚宓鞍祝ǎ希郑粒┳魑饫纯乖诒恢琢鱿赴闳『箦义
本文编号：2651684
【图文】：
通过双功能聚乙二醇（ＰＥＧ）、透明质酸（ＨＡ）与Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ三肽（ＲＧＤ）逡逑合成ＨＡ－ＰＥＧ－ＲＧＤ，通过静电相互作用力包被在载药胶束表面构建免疫纳米递药系统逡逑（见图１．５）。利用光控基因表达系统可控地在肿瘤细胞内表达白喉毒素的Ａ片段（ＤＴＡ）逡逑蛋白催化ＮＡＤ＋上的ＡＤＰ核糖基向ＥＦ－２转移，，进而抑制细胞的胞内蛋白质合成而表现逡逑毒性来杀伤肿瘤细胞及肿瘤新生血管细胞（见阁１．６途径①）。由白喉毒素杀死的肿瘤细逡逑胞释放出癌症相关抗原经树突细胞呈递后激活Ｔ细胞，从而X椉又琢銮颍韵赴氖义狭浚迹保锻揪盯郏Ｍ崩寐亚宓鞍祝ǎ希郑粒┳魑饫纯乖诒恢琢鱿赴闳『箦义
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