黄诺马苷人工抗原的合成及其单克隆抗体的制备

发布时间：2020-05-06 16:42

【摘要】：目的:合成并鉴定两色金鸡菊中活性成分黄诺马苷(Flavanomarein,FM)的人工抗原,免疫动物产生抗黄诺马苷的单克隆抗体,为两色金鸡菊及FM的免疫学应用奠定基础。方法:1.运用高碘酸氧化法将黄诺马苷与牛血清白蛋白(BSA)及人血清白蛋白(HSA)偶联,形成FM-BSA和FM-HSA人工抗原;运用曼尼希法(M annich)将黄诺马苷与阳离子化的牛血清白蛋白(cBSA)以及多聚赖氨酸(PLL)偶联,形成FM-cBSA和FM-PLL人工抗原;2.采用薄层色谱法对人工抗原进行鉴定,基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定FM-BSA和FM-HSA人工抗原的偶联比。3.采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测FM-cBSA和FM-PLL的蛋白浓度。4.采用合成的人工抗原FM-BSA、FM-cBSA和FM-PLL免疫BALB/c小鼠,FM-HSA免疫新西兰白兔。5.间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清抗体的效价,间接竞争ELISA法检测抗血清中抗体的特异性。6.硫酸铵沉淀法粗提兔血清中的单克隆抗体。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定单克隆抗体。7.采用间接竞争ELISA法检测抗黄诺马苷的单克隆抗体与其他化合物的交叉反应率。结果:1.薄层色谱结果显示人工抗原均偶联成功。2.MALDI-TOF-MS结果显示FM-BSA和FM-HSA的偶联比分别为4.77∶l和5.52∶l。3.蛋白浓度测定结果显示FM-cBSA和FM-PLL的蛋白浓度分别为1.44和0.61 mg·mL~(-1)。4.间接竞争ELISA结果显示,由FM-BSA、FM-cBSA和FM-PLL免疫的小鼠未产生稳定的抗黄诺马苷抗体,由FM-HSA免疫的新西兰白兔均产生了稳定的抗黄诺马苷单克隆抗体,检测范围10-160 ng·m L~(-1)。结论:成功合成黄诺马苷人工抗原,得到黄诺马苷单克隆抗体及黄诺马苷的ELISA检测方法,为两色金鸡菊及FM的免疫分析方法奠定了基础。
【图文】：

图2 FM-cBSA的薄层色谱图Figure2 TLC of FM-cBSA层鉴定结果在相同的展开条件，366 nm 紫外灯照射下，由于 PLL 是大分子蛋白物质，在相同的展开6 nm 紫外灯照射下也不会呈现相应的荧光斑照射下，合成产物 FM-PLL 并没有在与 FM 相应的荧光斑点。由此可以判断，该人工抗原的斑点，表明完全纯化去除小分子。

新疆医科大学硕士学位论文1.4 FM-BSA 和 FM-HSA 的 MALDI-TOF-MS 鉴定图 4-图 7 分别为 BSA，HSA，，FM-BSA，FM-HSA 的质谱图。由图 2 可知 BS的相对分子量（Mr）为 66770，由图 3 可知 HSA 的 Mr 为 66841，由图 4 可知 FM-BS的 Mr 为 68917，由图 5 可知 FM-HSA 的 Mr 为 69327，已知 FM 的 Mr 是 450.4，该结果表明FM-BSA中，每个载体蛋白BSA分子上偶联有4个[(68917-66770)/450.4] FM分子，该结果表明在 FM-HSA 中，每个 HSA 分子上连接有 5 个[(69327-66841)/450.4FM 分子，显示人工抗原合成成功，能够用于动物的免疫。
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R914

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本文编号：2651557