基于纳米技术共载多西他赛和PD-L1抗体的免疫化疗

发布时间：2020-05-07 22:12

【摘要】：本课题设计了一种智能化的pH敏感免疫脂质体(PDL),联合应用多西紫杉醇(docetaxel,DTX)介导的化学疗法和PD-L1介导的肿瘤免疫疗法来协同发挥高效的抗肿瘤效应。对所制备脂质体的理化性质、释药行为、体外细胞毒性、体内药效学、体内外安全性及其抗肿瘤机制进行探究,为该制剂进行临床转化,进一步应用于肿瘤治疗提供理论及实验基础。具体研究内容如下:(1)共载多西他赛和PD-L1抗体免疫脂质体的制备、表征及释药行为考察通过薄膜水化法和后插入法成功制备载DTX脂质体和共载DTX及PD-L1抗体的脂质体,抗体与PEG通过酰胺结合的方式被修饰在脂质体表面。TEM结果显示脂质体外观圆整,分布均匀;DTX-LP和PDL的平均粒径分别为113.6±2.991 nm和126.8±0.651 nm,PDI为0.252±0.005和0.232±0.010。在经过抗体修饰后,平均粒径上升,同时ζ电势由-41.5±0.306上升至-31.5±0.961,初步表明抗体已成功连接至脂质体表面。SDS-PAGE和共定位实验进一步证实脂质体表面抗体的成功连接。HPLC法测定DTX-LP的包封率高达94.32±0.10%,载药量约为5.91±0.001%。PDL包封率为91.39±1.09%,载药量为4.49±0.042%。脂质体表面较大的负电荷可帮助脂质体载溶液中更加稳定,并有效减少溶血现象的发生,具有较好的安全性和稳定性。通过动态膜透析法对脂质体的体外释药行为进行研究,结果显示在pH=7.4的中性条件下,DTX-LP和PDL都比游离药物释放速率要慢,在72h时累计释放率才为57.99%和62.41%,明显延长药物释放行为,保证了到达靶组织前脂质体的稳定性;而在pH5.0介质中药物能较快速地从脂质体中释放出来,72h释放量可分别达86.80%和90.03%,DTX-LP和PDL的体外释放具有明显的pH敏感性,在靶向部位可快速释放药物。(2)免疫脂质体的体外细胞毒性及靶向能力评价选取黑色素瘤B16-F10细胞为研究对象,在细胞水平研究各制剂的活性及功能。由于作用靶点是肿瘤细胞表面的PD-L1,首先通过流式细胞术验证B16-F10细胞表面PD-L1的表达。通过CCK-8法测得空白载体细胞毒性低、生物相容性好。在给药组中,细胞存活率不同给药组中均存在时间依赖性和浓度依赖性。48 h时游离DTX、DTX-LP和PDL半数抑制浓度(IC50)分别为12.46μg/mL、6.60μg/mL和0.93μg/mL,DTX-LP和PDL的IC50分别相当于游离药物的0.52倍和0.07倍,充分表明当主动靶向的脂质体具有更高的细胞毒性。凋亡实验结果也表明联合递送比单独给药拥有更强的凋亡诱导能力。DTX-LP和和PDL的凋亡诱导率分别为15.74±2.67%和26.17士3.71%明显高于游离DTX的9.26±0.90%制剂的毒性随着纳米化和主动靶向增加。采用免疫荧光染色和流式探究脂质体入胞机制和效率,结果显示PDL的摄取高于DTX-LP则是由于B16-F10细胞表而存在PD-L1,PDL的主动靶向能力使其更多的富集于胞内。竞争性实验也进一步验证其靶向能力是由PD-L1所介导。因此可初步推论,主动靶向脂质体能够显著提高药效,帮助药物更多的富集于靶部位发挥作用。(3)免疫脂质体的体内药效学及主动靶向能力研究将B16-F10黑色素瘤细胞接种于小鼠皮下,构建小鼠原位黑色素瘤模型,在动物水平检验不同药物和脂质体的相关药效学性质及靶向能力。采用脂质小分子荧光探针DiR替代DTX制备相应的脂质体(DiR-LP和DiR-PDL),通过使用近红外活体成像系统可实时监测游离药物或载体在体内的生物分布行为。所制备的DiR-PDL在体内观测和离体成像的肿瘤组织中均表现出更多富集,而在游离药物组中几乎检测不到肿瘤组织分布。DiR-PDL和DiR-LP在肿瘤组织的积累分别比游离药物高11.98倍和3.95倍,说明免疫脂质体可以有效地靶向肿瘤组织,从而减少副作用。体内药效学结果显示PDL具有最强的疗效,小鼠生存时间明显延长,且未造成小鼠体重降低。肿瘤组织切片TUNEL免疫荧光和Ki67免疫组化染色与药效学结果相符,PDL组的阳性率分别为58.81±14.16%和65.95±3.5%。充分验证免疫化学疗法可增强抗肿瘤免疫,同时有效杀伤肿瘤细胞来抑制肿瘤生长和延长小鼠存活率。(4)免疫脂质体的安全性评价及初步机制研究考察脂质体的安全性及抗肿瘤作用机制,为其临床转化提供数据支持和理论依据。通过测定肝功能指标ALT和AST及肾功能指标BUN的水平来间接评估药物的安全性。结果显示各参数均在正常范围内,初步表明制剂未对肝肾产生明显实质损伤。主要器官组织病理学检查显示,除游离药物组合外,各组织切片形态未表现出明显的病理异常。表明游离药物组合存在相对严重的全身毒性。进一步验证PDL可降低副作用。同时,通过免疫荧光染色对抗肿瘤免疫机制作初步探讨,PDL组可观察到肿瘤组织中富集最多的TILs和的颗粒酶B,表明免疫脂质体可促进体内TILs的募集和毒性。因此可推断PDL通过关闭PD-1/PD-L1途径引发CD8+T细胞介导的强效肿瘤细胞杀伤,与DTX的细胞毒性协同产生强力抗肿瘤作用,同时具有良好的安全性和应用前景。
【图文】：

机制,肿瘤细胞,抗肿瘤免疫,群表

逑变导致胶质细胞瘤中的ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ通路激活３°，而９ｐ２４．邋１基因在某些淋巴瘤中逡逑的易位或扩增３１’３２，最终可导致ＰＤＬ１在大多数肿瘤细胞表面广泛表达（图１）。逡逑ＰＤ－Ｌ１逦，／＇１邋ｌｎｎａ，ｅ邋＿逡逑？Ｑ邋－＾—邋ｒ－／／邋！逡逑一邋Ｐｉ．＼逦ＴＵｍｏｒｃｅ，，邋Ｕ邋逦：曼逦：逡逑＾！邋－＾４＾，邋Ｊｊ＾ｙ邋＜－：：－邋－■逡逑？邋：yィò耍簦皱义希獭蓿危荆澹觥瑰危撸澹悖幌﹀义稀⒁蝗薔B逡逑图１肿瘤内部ＰＤＬｌ表达的机制。肿瘤细胞的ＰＤＬｌ的组成型广泛（先天）逡逑表达被认为是由失调的信号传导途径或染色体改变和扩增驱动的。肿瘤细胞和巨逡逑噬细胞的ＰＤＬ１的局部表达发生在肿瘤细胞群表面，同时分泌促炎因子如干扰素逡逑－ｙ邋（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，，邋ＩＦＮ－ｙ）＝邋ＰＤＬｌ与ＰＤ１分子的连接将下调Ｔ细胞功能，产生抑逡逑制抗肿瘤免疫的负反馈结果。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｆｏｒ邋ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ邋ＰＤＬｌ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．邋Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ邋ｂｒｏａｄ逡逑（ｉｎｎａｔｅ）邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ邋ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ邋ｃｅｌｌ邋ｄｅａｔｈ邋１邋ｌｉｇａｎｄ邋１邋（ＰＤＬｌ）邋ｂｙ逡逑ｔｕｍｏｒ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｓ邋ｔｈｏｕｇｈｔ邋ｔｏ邋ｂｅ邋ｄｒｉｖｅｎ邋ｂｙ邋ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙｓ

示意图,脂质体,示意图

４．１设计思路逡逑近来研究者普遍认为某些化疗可以与免疫疗法协同作用，从而改善疗效和预逡逑后。本课题设计了一种智能化的ｐＨ敏感免疫脂质体（ＰＤＬ），选择二油酰磷脂酰逡逑乙醇胺（ＤＯＰＥ）和大豆卵磷脂（ＳＰＣ）为磷脂双分子层的基础材料，琥珀酸胆固醇逡逑单酯（ＣＨＥＭＳ）为ｐＨ敏感材料，该系统以ｐＨ敏感性脂质体为基础，双分子层内逡逑负载化疗药物多西他赛；脂质体外层ＰＥＧ链上接ＰＤ－Ｌ１单克隆抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ逡逑ａｎｔｉｂｏｄｙ，邋ｍＡｂ）。在脂质体表面修饰的ＰＤ－Ｌ１邋ｍＡｂ，可以准确地耙向肿瘤细胞，关逡逑闭免疫抑制性的ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１通路，同时ＤＴＸ可直接杀伤肿瘤细胞。通过薄膜水逡逑化法制备脂质体，联合应用多西他赛（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ，ＤＴＸ）介导的化学疗法和ＰＤ－Ｌ１逡逑介导的肿瘤免疫疗法来协同发挥高效的抗肿瘤效应。对所制备脂质体的理化性质、逡逑体内外释药行为、体外细胞毒性、体内药效学、体内外安全性及其抗肿瘤机制进逡逑行探究，为该制剂后续临床转化，进一步应用于肿瘤治疗提供理论及实验基础。逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943

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