抑制HBV复制的CDK2激酶抑制剂的筛选及鉴定

发布时间：2020-05-11 15:43

【摘要】：目的:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)特异性感染肝细胞,引起急性感染和慢性感染,其中慢性感染是肝硬化和肝细胞癌的主要原因。现有治疗慢性乙肝的临床药物中,长期使用核苷类似物容易导致耐药,存在停药反弹,而干扰素治疗应答较低,因此寻找新的抗乙肝药物是亟待解决的问题。从病毒-宿主角度出发,寻找直接的抗病毒药物和基于宿主因子作为靶点有助于丰富抗乙肝药物的研发策略。SAMHD1(Sterile alpha motif(SAM)and histidine/aspartic acid(HD)domain-containing protein 1)是一种肝细胞内重要的宿主限制性因子,能够通过其脱氧核苷三磷酸水解酶(dNTPase)活性抑制多种病毒复制。最近研究发现,在HIV-1感染的增殖细胞中,SAMHD1蛋白的T592位点的磷酸化受细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的调控。磷酸化的SAMHD1丧失了其抗病毒作用。但是在HBV感染中,哪种CDK激酶主要参与调控SAMHD1的磷酸化和抗病毒作用尚不清楚,同时,CDK激酶抑制剂是否能通过抑制SAMHD1的磷酸化,从而作为抗乙肝的药物尚未见报道。因此本文主要鉴定了HBV感染的肝细胞中,细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2参与调控了SAMHD1磷酸化和病毒的复制,进一步从现有的多种CDK2激酶抑制剂中筛选出有效抑制SAMHD1磷酸化和病毒复制的CDK2激酶抑制剂。我们的研究结果表明:在肝细胞中,CDK2与SAMHD1共定位于细胞核内,二者可以相互作用,CDK2能够调控SAMHD1的磷酸化和HBV的复制;另一方面,对现有靶向CDK2激酶的抑制剂进行抗病毒功能筛选:我们鉴定并筛选出CDK2 inhibitor II和CDK2 inhibitor III能够通过抑制SAMHD1磷酸化发挥抗HBV作用。研究结果有助于阐明HBV感染宿主肝细胞后,CDK2激酶磷酸化宿主限制性因子SAMHD1,限制其抗病毒的机制,并以CDK2激酶为靶点筛选出了两种抑制HBV复制的化合物(CDK2 inhibitor II和CDK2 inhibitor III),为探索HBV的临床治疗药物提供了新的方向。方法:研究分为两部分。第一部分:鉴定出CDK2激酶参与调控SAMHD1磷酸化。(1)在Huh7.0细胞中,共转染外源性表达的SAMHD1和CDK1或CDK2,通过Co-IP(Co-Immunoprecipitation)探究在Huh7.0细胞中,SAMHD1与CDK1或CDK2的相互作用;(2)通过免疫荧光研究了SAMHD1和CDK2在Huh7.0细胞中的定位;(3)在Huh7.0细胞中通过siRNA分别干扰CDK1和CDK2的表达,分别提取细胞总蛋白,病毒核心颗粒及HBV表面抗原,通过Western blot,Southern blot,qPCR及ELISA检测siCDK1和siCDK2对SAMHD1磷酸化和病毒复制的影响。第二部分:抑制HBV复制的CDK2激酶抑制剂的筛选和鉴定:(1)通过MTT法检测了现有的13种CDK2抑制剂对细胞毒性的影响:将靶向CDK2的特异性抑制剂作用于HBV稳定复制的细胞HepAD38,通过MTT法检测CDK2抑制剂对细胞毒性的影响,筛选出细胞毒性较小的4种CDK2激酶抑制剂;(2)在HepAD38细胞上研究CDK2抑制剂对SAMHD1磷酸化和病毒复制的影响:CDK2抑制剂作用于过表达SAMHD1的HepAD38细胞中后,提取细胞总蛋白,病毒核心颗粒及总RNA,用qPCR检测CDK2抑制剂对HBV复制的影响,Western blot检测其对SAMHD1磷酸化水平的影响;(3)在Huh7.0细胞研究CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ对细胞周期、SAMHD1磷酸化和病毒复制的影响:将CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ作用于过表达SAMHD1的Huh7.0细胞,通过流式细胞术检测细胞周期的变化;分别提取细胞总蛋白和病毒核心颗粒,Western blot检测CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ对SAMHD1磷酸化水平的影响,qPCR检测其对HBV复制的影响;(4)进一步利用siRNA干扰SAMHD1的表达,检测CDK2激酶抑制剂对HBV复制的抑制作用是否依赖于宿主限制性因子SAMHD1的磷酸化。结果:第一部分,我们鉴定了在HBV感染肝细胞中,CDK2激酶参与调控了SAMHD1的磷酸化:(1)通过Co-IP试验研究了SAMHD1与CDK2在Huh7.0细胞中存在相互作用;(2)通过免疫荧光检测了SAMHD1和CDK2在Huh7.0中均定位在细胞核内;(3)干扰CDK1或CDK2后,Southern blot及qPCR检测发现干扰CDK2可以抑制HBV DNA的复制,而干扰CDK1对HBV的复制没有明显作用;通过ELISA显示干扰CDK1或CDK2的表达对HBV表面抗原水平无明显影响;Western blot检测发现,干扰CDK2表达后,SAMHD1的磷酸化水平明显下降,而干扰CDK1的表达后,SAMHD1的磷酸化水平没有明显变化。综上所述,我们发现在肝细胞中,CDK2激酶和SAMHD1蛋白存在相互作用,且二者共定位于细胞核中;进一步利用RNA干扰,鉴定出在肝细胞中CDK2激酶参与调控SAMHD1的磷酸化和HBV的复制。第二部分:抑制HBV复制的CDK2激酶抑制剂的筛选和鉴定:(1)在现有的13种CDK2激酶抑制剂中,通过MTT法首先筛选出4种细胞毒性相对较小的CDK2抑制剂;(2)在HBV稳定复制的细胞系HepAD38细胞上筛选出两种显著抑制病毒复制和SAMHD1磷酸化的CDK2抑制剂:将上述4种CDK2激酶抑制剂作用于过表达SAMHD1的HepAD38细胞中后,提取病毒核心颗粒,通过qPCR检测发现CDK2inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ在5μM的浓度显著抑制HBV复制,通过Western blot检测发现,随着CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ药物浓度的增加,SAMHD1的磷酸化水平逐渐减弱。此外,通过qPCR检测发现CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ对病毒的RNA水平无明显作用。结果表明CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ可以降低SAMHD1的磷酸化和抑制HBV的复制,这种抗病毒作用主要发生在病毒DNA的复制环节;(3)在Huh7.0细胞上验证CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ对SAMHD1磷酸化和病毒复制的调控:流式细胞术检测发现,加入CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ后,细胞停滞在G0/G1期,提取病毒核心颗粒,qPCR检测结果表明,随着CDK2inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ浓度的增加,病毒复制水平逐渐降低。Western blot检测发现,随着CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ浓度的增加,SAMHD1的磷酸化水平逐渐减弱;进一步干扰内源性SAMHD1表达后,CDK2抑制剂抑制HBV的作用消失,表明CDK2抑制剂抗HBV复制依赖于SAMHD1的磷酸化。结论:在HBV感染的肝细胞中,CDK2激酶参与了宿主限制性因子SAMHD1的磷酸化和病毒复制的调控;CDK2激酶可以与宿主限制性因子SAMHD1直接发生相互作用,二者共定位于细胞核;我们筛选出CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ,能够在肝细胞中通过调控SAMHD1的磷酸化而发挥抗病毒作用。
【图文】：

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图 2.1 SAMHD1 与 CDK2 的相互作用Fig 2.1 Interaction between SAMHD1 and CDK2 和 SAMHD1 的细胞共定位一步明确 CDK2 及 SAMHD1 在肝细胞中的定位，我们通D1 在 HepAD38 细胞中的定位：结果显示 SAMHD1 和 C。由此说明 CDK2 与 SAMHD1 的相互作用发生在细胞核
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R512.62;R978.7

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本文编号：2658690