反应氧族介导K562肿瘤细胞形成多药耐药及机制研究

发布时间：2020-05-12 06:00

【摘要】：目的:通过长期孵育H_2O_2建立人白血病细胞K562耐药模型,考察反应氧族介导的肿瘤细胞产生多药耐药的机制。方法:使用荧光倒置显微镜观察DCFH-DA染色后人白血病细胞K562和耐药细胞K562/A02的细胞内ROS(Reactive Oxygen Species)的分布和荧光强度,使用流式细胞仪检测DCFH-DA染色后人白血病细胞K562和耐药细胞K562/A02的细胞内的ROS含量。选用不同浓度的H_2O_2进行造模时间和浓度筛选,采用MTT法测定阿霉素(Adriamycin,ADM)对模型K562细胞的抑制率,根据筛选结果选取H_2O_2的造模时间和浓度,以此建立的耐药细胞模型命名为K562/ROS细胞。使用倒置显微镜观察K562/ROS细胞的形态学改变。采用MTT法测定各浓度紫杉醇(Taxol)、顺铂(Cisplatin,cDPP)、环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)、阿霉素和5-氟尿嘧啶(5-Flourouracil,5-FU)对K562/ROS细胞的抑制率,计算各抗肿瘤药物的IC_(50)和模型细胞的耐药指数(Resistant Index,RI)。使用PI单染法对K562、K562/ROS、K562/A02细胞染色,流式细胞仪检测三组细胞的周期分布。使用DCFH-DA染色法对K562、K562/ROS、K562/A02细胞染色,流式细胞仪检测三组细胞内ROS的含量变化。使用Western blot法检测三组细胞P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达;流式细胞术检测K562、K562/ROS、K562/A02细胞对罗丹明123(Rhodamine,Rh123)的累积能力、反应P-gp的活性;免疫染色后使用激光共聚焦显微镜观察K562、K562/ROS、K562/A02细胞中P-gp和掺入的BrDU的定位与含量;另对K562,K562/ROS、K562/A02细胞孵育PI3K和NF-κB的抑制剂LY294002、BAY11-7082,MTT法检测三组细胞对ADM耐药性的变化;采用激光共聚焦显微镜检测K562、K562/ROS、K562/A02细胞中耐药、增殖相关的核转录因子NF-κB和的表达与定位;Western blot法检测细胞内p-Akt、p-IκB、p-STAT3、P-gp的表达,分析K562/ROS细胞耐药产生的机制。结果:人白血病耐药细胞K562/A02内ROS的荧光强度高于敏感细胞K562,其含量约为敏感株细胞的2.46±0.34倍。经条件筛选,0.1μmol/L的H_2O_2连续孵育12周建立的耐药细胞模型命名为K562/ROS细胞。K562/ROS的细胞形态较敏感株发生较大的改变,由原来的圆形变为多毛刺、不规则状,细胞对瓶底的附着力增加,悬浮态减少,细胞呈团片状生长,细胞连接处模糊、增殖速度加快、代谢活性增加。K562/ROS细胞具有多药耐药性,对紫杉醇、顺铂、环磷酰胺、阿霉素、5-氟尿嘧啶的耐药指数分别为292.82、3.35、4.41、52.65、1.73。与K562细胞相比,耐药细胞K562/ROS的G_2/M期所占比例有显著增加。ROS含量检测结果表明:长期适量的H_2O_2孵育可升高K562细胞内的基础ROS的浓度水平。Western blot及激光共聚焦检测结果表明:长期调控ROS可诱导K562细胞表达P-gp,增加的P-gp主要分布在细胞膜上。Rh123的累积实验结果提示,K562/ROS细胞上表达的P-gp具有较强的外排功能。通过机制研究发现:PI3K和NF-κB的抑制剂可不同程度的逆转K562/ROS细胞的耐药性,其结果与K562/A02细胞情况相似。使用PI3K的抑制剂LY294002可降低p-Akt的表达、抑制NF-κB的入核、减少p-STAT3、P-gp的含量。使用NF-κB的抑制剂BAY11-7082可抑制NF-κB的入核、降低p-STAT3、P-gp的表达,对p-Akt的含量无显著影响。同时使用LY294002和BAY11-7082均可显著下调K562/ROS细胞p-STAT3、P-gp的表达,与对K562/A02细胞作用相似。结论:人白血病耐药株ROS的基础含量显著高于其敏感株。通过对K562细胞长期定量孵育ROS可促进细胞产生多药耐药,该耐药细胞命名为K562/ROS。K562/ROS细胞主要特征表现为:细胞内ROS含量增加、细胞形态变化、外排蛋白功能与表达增强、细胞周期改变、细胞增殖加速。耐药机制可能涉及过度激活的PI3K通路,通过诱导NF-κB核转录、激活STAT3通路,进而上调细胞上P-gp的功能与表达,最终介导肿瘤多药耐药产生。
【图文】：

细胞内,荧光强度,代表性,图片

显微镜观察下 K562 和 K562/A02 细胞内 ROS 的荧光强度及分布（200×代表性图片。62 和 K562/A02 细胞内 ROS 含量的差异 K562/A02 细胞经终浓度为 10μmol/L 的 DCFH-DA 染色后，，用 K562/A02 细胞内 ROS 的含量，如图 1-2 所示，表明耐药细胞细胞株内的 ROS 含量，K562/A02 细胞内 ROS 含量约是 K。

流式细胞仪检测,代表性,图片,存活率

图 1-2 流式细胞仪检测 K562 和 K562/A02 细胞内的 ROS 含量，n=3,上图为 3 次实验中代表性图3.2 K562/ROS 耐药模型的建立及其建立过程评价3.2.1 K562/ROS 耐药细胞给药浓度的筛选以用不同浓度的H2O2对人白血病细胞K562细胞进行给药浓度筛选，如图1-3所浓度大于 10μmol/L 的 H2O2作用 2 天对 K562 细胞的存活率有显著抑制的作用。浓度1μmol/L~10μmol/L 的 H2O2作用 2 周对 K562 细胞的存活率有显著抑制作用、0.1μmol/L~1μmol/L 浓度的 H2O2作用 1 个月仍会导致 K562 细胞大量死亡，因此选用K562 细胞的存活率无影响的 0.1μmol/L 浓度的 H2O2进行后续试验（筛选结果略）。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96

【参考文献】