功能各异的益生菌复合缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎机制研究

发布时间：2020-05-12 05:17

【摘要】：溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是发生在盲肠及结直肠的慢性炎症性疾病,可导致多种严重的肠道外炎症表现和并发症,甚至诱发结直肠癌,已成为全球性的公共健康威胁。目前,UC的一线治疗药物无法满足临床需要,迫切需要开发新的UC治疗策略。益生菌降低肠道炎症、增强肠道稳态的功能得到越来越多的关注。目前虽然有益生菌治疗结肠炎的报道,但是不同益生菌的作用效果差异明显,而且需要更多的研究来剖析多菌种复合制剂的优势和作用机制,并指导益生菌的使用。另外,肠道微生物及其功能的相关认识的积累,正在改变对益生菌的理解和使用模式。传统的益生菌种类有限,已经明显不能满足对更多类型疾病治疗的需求。开发哺乳动物肠道中的共生微生物资源,有助于发现新的有价值的微生物和药物分子。在中医上,发酵中药六神曲(Massa Medicata Fermentata,MMF)和中草药地锦草(Euphorbia humifusa Willd.)被用于治疗胃肠道疾病。但是,关于MMF和地锦草对UC的治疗潜力及其对肠道微生物影响的报道还很少,并且它们的副作用需要进一步明确。评估MMF和地锦草对肠道炎症和损伤的治疗效果和机制,对于开发潜在的UC治疗药物,明确中药的适用范围具有重要的意义。本研究旨在开发动物肠道共生微生物,发掘安全、高效的新型益生菌资源,并探究益生菌和中药对UC的治疗潜力和作用机制。本论文主要包括以下三部分的研究内容:(1)松辽黑猪仔猪肠道微生物资源的开发与安全性分析。松辽黑猪是中国东北地区的地方猪种,其优良的生长特性很大程度上得益于自身的肠道微生物,而目前对松辽黑猪肠道微生物的研究还非常少。为了筛选安全高效的新型益生菌,我们选取经益生菌发酵的六神曲替代抗生素饲喂松辽黑猪仔猪,以此作为分离来源,利用五种培养基(改良M17培养基、M2GSC培养基、MRS培养基、PTYG培养基和LB培养基),分离仔猪消化道不同部位的微生物。通过对比细菌菌落形态、革兰氏染色反应和限制性片段长度多态性分析(RFLP)结果,对分离菌株进行初步分类。然后通过溶血性分析,筛选得到不溶血的菌株;对这些菌株进行16S rRNA分子鉴定。最后,用药敏纸片法分析了菌株对8种抗生素(氯霉素、链霉素、万古霉素、四环素、庆大霉素、氨苄西林、卡那霉素和克林霉素)的敏感性。我们分离并保存了362株微生物,初步筛选出90株代表菌株进行了溶血性分析,有59株细菌表现为不溶血。细菌的16S rRNA分子鉴定结果显示,分离菌株来自4个门12个属,其中菌株BMJA-M17-12、BMJA-M17-32和BMJAM17-29与NCBI数据库中亲缘关系最近微生物的相似度分别为95.15%、95.81%和97.25%,表明有可能是新种微生物。抗生素敏感性实验结果显示,除BMXAM17-3(比对结果为Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)对2种抗生素敏感外,其他菌株对至少5种抗生素敏感。分离的益生菌菌株Lactobacillus reuteri RAM0101,Bacillus coagulans RAM1202和Clostridium butyricum RAM0216对8种抗生素全部敏感。(2)益生菌和中药对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠肠道炎症和损伤的缓解作用研究。利用DSS诱导的UC小鼠模型,以临床上治疗UC的药物柳氮磺胺吡啶(SASP)作为阳性对照,评估复合益生菌剂(L.reuteri RAM0101,B.coagulans RAM1202,Bifidobacterium longum CICC6197和C.butyricum RAM0216)、中药MMF和地锦草治疗UC的潜力。我们对比了四种干预对模型小鼠疾病表现(体重丢失、腹泻、便血、死亡率)的治疗作用。利用HE染色评估了结肠组织病理学损伤和炎性细胞浸润情况,通过RT-qPCR和Western blot分析了对结肠黏膜炎症因子水平和肠道屏障功能的影响,并利用Illumina Hiseq测序平台分析了药物对结肠黏膜微生态修复的作用。结果表明,SASP降低了结肠炎性细胞浸润和促炎性细胞因子TNF-α,IL-6和IL-1β的mRNA水平,但不能缓解紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的降低;MMF对DSS诱导的结肠炎没有治疗效果;地锦草缓解了结肠炎小鼠的疾病活动指数(DAI)和结肠组织病理学损伤,并降低了小鼠的死亡率和结肠黏膜中促炎性细胞因子的mRNA水平,但增加了结肠黏膜中促炎性微生物Proteobacteria和Cyanobacteria的比例;四株益生菌的组合显著缓解了结肠炎小鼠的疾病表现,降低了结肠组织病理学损伤和促炎性细胞因子TNF-α,IL-6和IL-1β的mRNA水平,缓解了紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的降低。益生菌复合物还恢复了结肠黏膜中核心微生物群的相对丰度,降低了促炎性细菌的比例,并增加了有益细菌Bifidobacterium和Blautia的比例。以上研究结果表明,四株益生菌的组合比临床抗炎药物SASP和中药地锦草和六神曲更有利于修复肠道微生态和屏障功能的损伤,并有效降低肠道炎症,增强肠道稳态。(3)复合益生菌改善宿主肠道炎症和损伤的机制研究。我们进一步对比了单一菌株和四株益生菌的复合物对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗效果,旨在探究复合益生菌剂缓解结肠炎的作用机制,并明确单一菌株与复合益生菌治疗效果的差异。利用RT-qPCR和Western blot分析了结肠黏膜炎症因子水平和肠道屏障功能相关蛋白质的水平;使用基于Pacbio Sequel测序平台的全长16S rRNA测序,分析了结肠黏膜的微生物组成。结果显示四株益生菌对DSS诱导的结肠炎的治疗效果不同,C.butyricum RAM0216和B.coagulans RAM1202比L.reuteri RAM0101和B.longum CICC6197的保护作用更强;这四株益生菌分别调节了不同的结肠黏膜细胞因子和屏障功能相关基因的mRNA水平;四株益生菌的组合表现出了菌株之间的协同作用,显著地降低了促炎性细胞因子以及IL-22和Reg3γ的mRNA水平,并增加了MUC-2,Occludin,Claudin-1和抗炎细胞因子IL-10的mRNA水平;复合益生菌比单一益生菌更显著地降低了结肠黏膜中促炎性细菌Cyanobacteria和Proteobacteria的相对丰度,增加了抗炎细菌Akkermansia,Blautia和Lactobacillus的相对丰度。以上结果表明,四株益生菌调节了不同的肠道免疫应答通路和屏障功能。四株不同功能的益生菌的复合比单一益生菌更有效地降低了肠道屏障的损伤和抗原的入侵,并修复了结肠黏膜微生物生态。综上所述,本研究利用多种培养条件,从益生菌发酵的六神曲替代抗生素饲喂的松辽黑猪仔猪的消化道中分离肠道共生微生物,筛选出不溶血,而且对抗生素敏感的潜在益生菌。动物实验结果表明,不同的益生菌菌株调节了不同的肠道免疫应答途径和屏障功能。不同功能的益生菌的组合比抗炎药物SASP和中药地锦草更有效地修复结肠黏膜微生态,恢复肠道微生物与免疫生态位之间相互作用的平衡,增加结肠黏膜屏障功能和IL-10的水平,进而缓解肠道炎症和损伤。
【图文】：

菌落形态,溶血性,阳性对照,菌株

吉林大学博士学位论文.2.3.5 分离菌株的溶血性分析按照 2.2.1.1 配制哥伦比亚血琼脂培养基，将分离纯化的菌株划线于哥伦血琼脂平板。37°C 厌氧培养 18 24h，观察菌落形态。α-溶血表现为狭小的绿色溶血环；β-溶血表现为宽大的、界限分明的、完全透明的溶血环[101]；γ为不溶血，即不出现溶血环。分离自临床患者粪便的 Aerococcusspp.RAM03为 α-溶血阳性对照菌株（图 2.1A），StreptococcuspyogenesCICC10373 作为血阳性对照菌株（图 2.1 B）。

松辽黑猪,部分分离,革兰氏染色,菌落形态

部分分离菌株的菌落形态及革兰氏染色结果
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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