新型微管蛋白抑制剂A3的抗肿瘤作用及机制研究

发布时间：2020-05-12 23:35

【摘要】：实验背景:肿瘤是一种常见且多发的疾病,在今天依然威胁着人类的生命和健康。引起肿瘤发生的因素有很多,例如外在的环境因素中物理、化学和生物致癌因素,内在的人体自身免疫功能及遗传因素等。肿瘤之所以难以攻克,主要原因是肿瘤的发生是一种涉及肿瘤细胞异常生长且入侵到身体其他正常部位所诱发相关疾病的集合。微管在细胞有丝分裂过程中扮演重要角色,这一重要作用使得微管成为抗肿瘤治疗的重要靶标,而微管蛋白是构成微管系统必不可少的基础单位。若微管蛋白遭到破坏,微管系统则会失去其稳定性,最终对细胞有丝分裂的影响也是不言而喻的。基于微管蛋白在细胞中具有的重要行为,能与微管蛋白相互作用的药物也越来越多的被开发和研究,同时一些已经在临床上被批准用于肿瘤的治疗。实验目的:本实验就新型微管蛋白抑制剂A3对人宫颈癌HeLa细胞活性的评价及其抗肿瘤作用机制的研究。实验方法:采用微管蛋白聚合筛选试剂盒分别对紫杉醇、CA-4及A3进行微管蛋白聚合抑制的检测。用免疫荧光法检测不同浓度的A3对HeLa细胞内微管蛋白的影响。采用MTT法检测A3对HeLa细胞生长增殖的影响。用倒置荧光显微镜观察A3对HeLa细胞的形态学及细胞内微管蛋白的影响。采用高内涵活细胞成像系统(HSC)检测A3对HeLa细胞线粒体膜电位(Rh123/Hoechst 33342)、活性氧(DCFH-DA/Hoechst 33342)的影响。用流式细胞仪检测A3对HeLa细胞的周期(PI)、凋亡(FITC AnnexinV/PI)、线粒体膜电位(JC-1)及活性氧(DHE)的影响。用细胞划痕和Transwell实验检测A3对HeLa和HUVEC细胞迁移的影响。采用Western blotting检测A3对HeLa细胞内周期相关蛋白(cyclin B1、cyclin D1)、凋亡相关蛋白(Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、XIAP)及细胞色素C变化的影响。用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行小管形成实验来检测A3的抗血管生成能力。实验结果:1、高通量微管蛋白聚合筛选试剂盒检测发现A3能抑制微管蛋白的聚合,并且成剂量依赖性。2、免疫荧光法检测发现A3能影响HeLa细胞内微管蛋白的变化,且使其分布呈弥散状。3、MTT实验检测发现A3对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用,并且呈时间与剂量依赖性。4、通过细胞形态学观察发现A3诱导HeLa细胞发生了凋亡。5、流式细胞仪检测发现A3能诱导HeLa细胞发生明显的G2/M期阻滞及凋亡,同时还能引起细胞内线粒体膜电位的降低及活性氧的变化。6、细胞划痕和Transwell实验发现A3能抑制HeLa与HUVEC细胞的迁移。7、Western blotting检测发现A3能调控HeLa细胞的周期相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达,并且呈时间与剂量依赖性。8、小管形成实验发现A3能够抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形成小管,表现出了抗血管生成的作用。实验结论:新型微管蛋白抑制剂A3对HeLa细胞表现出了明显的细胞毒性作用。主要是以微管蛋白为作用靶标,通过抑制微管蛋白的聚合,引起HeLa细胞的周期停滞,再经线粒体途径诱导HeLa细胞凋亡的发生,同时还具有抑制HeLa细胞的迁移及周围血管的生成,最终发挥抗肿瘤作用。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96

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本文编号：2661002