超分辨显微技术示踪线粒体与溶酶体相互作用研究方法的建立及其在药物评价中的应用

发布时间：2020-05-13 06:25

【摘要】：线粒体与溶酶体相互作用,包括线粒体与溶酶体融合和线粒体与溶酶体接触,是真核细胞中维持细胞稳态的重要过程,涉及到许多疾病。然而目前对于线粒体与溶酶体的相互作用的研究方法仍停留在细胞水平,对亚细胞器纳米级动态相互作用的研究仍十分有限。在这里,我们突破以往针对单个细胞器进行研究的局限和常规显微镜分辨率的限制,以线粒体与溶酶体相互作用为研究主线,借助超分辨显微成像技术的优势,建立了在纳米水平下线粒体与溶酶体相互作用研究的新方法,扩展了超分辨成像在药物评价中的应用。首先,在超分辨显微镜下捕获了不同条件下的线粒体与溶酶体互作的类型并对不同类型进行了定量分析;然后,为了更好的观测线粒体与溶酶体的相互作用,开发了一个可以在超分辨显微镜下进行长时监测线粒体动力学的铱(Ⅲ)配合物探针;为了特异性成像线粒体与溶酶体的接触位点以及简化现行的染色过程,制备了一个可以同时成像线粒体与溶酶体的双标探针;同时揭示了 VAMP8蛋白可作为线粒体与溶酶体相互作用网络中关键的药物调控靶点;最后,以线粒体与溶酶体相互作用为模型,从多个角度论证了超分辨成像作为药物评价新策略的准确性。1 超分辨成像揭示线粒体与溶酶体的相互作用超分辨光学显微镜将细胞生物学的范围从细胞水平扩展到纳米尺度,使研究人员能够观察单个线粒体与溶酶体的相互作用行为,如接触或者融合。为了在超分辨显微镜下捕获线粒体与溶酶体的相互作用行为并对这些行为进行区别。在这里,我们使用结构光照明显微镜(structured illumination microscopy,SIM)来研究线粒体与溶酶体的相互作用并提出M值(其值为垂直于线粒体和溶酶体接触方向荧光强度的重叠区域)来定量研究和区分线粒体的接触和融合等不同的相互作用形式。我们发现线粒体与溶酶体接触的M值通常小于0.4,而在线粒体与溶酶体融合的M值范围在0.5到1.0之间。使用超分辨显微镜以及M值定量系统可有助于进一步研究线粒体与溶酶体相互作用的分子机制。2 长时铱(Ⅲ)配合物荧光探针追踪线粒体动力学并用于监测线粒体与溶酶体相互作用目前,商用线粒体探针普遍存在易光漂白等缺点,并不能满足在SIM下长时间观测线粒体动力学的需求。为此,我们开发了一种铱(Ⅲ)探针,用于实现在SIM下长时间跟踪活细胞中的线粒体,开展线粒体动力学研究。结果表明,该探针表现出优异的线粒体成像特异性和光稳定性以及细胞渗透性。当在SIM下成像线粒体时,可捕获高达80 nm的分辨率,从而可以清晰地观察到线粒体嵴的结构。然后,我们使用该探针与商用的溶酶体探针搭配使用来研究线粒体与溶酶体的相互作用行为,如线粒体与溶酶体的接触和融合。结果表明,当5个自噬相关受体p62、NDP 52、OPTN、NBR 1和TAX1BP 1被敲除时,线粒体与溶酶体的接触保持存在,而融合消失,表明这两个过程是独立的。这一探针的开发,为在超分辨下研究线粒体与溶酶体的互作研究方法的建立提供了有力的工具。3 双靶向探针用于同时成像活细胞中线粒体与溶酶体相互作用已经开发了各种优异荧光探针来分别成像线粒体与溶酶体来研究其互作,但是,目前并不能突破一个探针可同时成像线粒体与溶酶体的技术壁垒。为了解决这个问题,我们设计了一种细胞渗透性高,生物相容性好,且响应黏度的小分子探针,Coupa,以同时监测活细胞中线粒体与溶酶体的相互作用。这个探针可通过在溶酶体上发射红光,而在线粒体上发射蓝光来同时标记线粒体和溶酶体。利用红蓝荧光强度之间的相关性可衡量在生命过程中线粒体与溶酶体的接触和融合所处的阶段。此外,该探针的荧光具有极高黏度性敏感性,可识别并定位线粒体与溶酶体接触位点。基于该探针的优越性,我们首次揭示了线粒体与溶酶体的接触位点与线粒体局部黏度变化有关。因此,该探针的开发为超分辨在活细胞中研究线粒体与溶酶体相互作用以及接触位点的识别提供了一个有力的工具。4 溶酶体与线粒体相互作用网络的维持和调控靶点蛋白发现在线粒体与溶酶体相互作用过程中,溶酶体会以聚集簇的形式围绕在线粒体周围,为了明确在互作过程中溶酶体聚集簇的形成原因和调控机制,我们对此进行了深入研究。在线粒体与溶酶体相互作用过程,自噬体包裹受损的线粒体再与溶酶体融合来执行细胞自噬的过程。溶酶体与自噬体问的融合过程是自噬的关键步骤。虽然已经发现了许多蛋白可调节这个融合过程,但是溶酶体形成聚集簇样的融合前状态和调节机制仍然是未知的。本研究的结果表明,在细胞受到刺激后,多个溶酶体可形成聚集簇与自噬体进行融合,这一聚集簇的形成是为了提高细胞的自噬效率。此外,溶酶体上的融合蛋白VAMP8在溶酶体聚集簇形成过程中起到了双向调节作用。如在正常条件下,细胞通过VAMP8的磷酸化起到了抑制融合的作用,阻碍融合以抑制自噬的发生;在应急状态下,细胞通过VAMP8的去磷酸化起到了加速融合的作用,以增加自噬的发生。这些结果表明,VAMP8可作为一个调控靶点调节溶酶体与线粒体互作网络的形成。5 基于线粒体与溶酶体互作模型的药物评价和筛选基于超分辨显微技术以获得纳米级药效学评估是一种具有潜力的高通量筛选新策略。在这里,我们以线粒体与溶酶体相互作用为模型,结合自动分析软件论证了这一策略作为药物筛选和评价的可行性。该策略可在纳米水平捕获药物对线粒体的超微结构的变化,以及线粒体与溶酶体相互作用的细微差别,并可直接反映出基因缺陷和药物对相互作用的干预。此外,该策略还提供了超高分辨率的图像有利于提高大规模人工智能图像识别的准确率,并有可能缩短药物的研发周期。
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山东大学博士学位论文线粒体的外膜与质膜类似，其蛋白质－磷脂比例为线粒体的内膜中蛋白质－磷脂比（大于３：邋１），这差，也是众多荧光探针能够用来标记线粒体的原因在外膜和内膜的中间部分，含有小分子，如离子粒体的内膜弯曲形成的褶皱结构以增加表面积，，］。逡逑该结构由内膜所包裹，其体积约为线粒体总体积的邋ｍｔＤＮＡ存在于线粒体基质，呈现小圆状的形式。逡逑

可被两个溶酶体组织蛋白酶Ｂ和Ｄ所切割，然后ＢＩＤ激性，导致细胞色素Ｃ的释放和依赖于凋亡小体的ｃａｓｐａｓｅ和自噬逡逑胞自行降解大分子物质和循环再利用的过程，包括大自导的自j（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ邋ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ａｕｔｏｐｈａｇｙ，ＣＭＡ）邋［２８］。内质网来源的膜形成自噬体，与溶酶体融合（图１．３）形受损的细胞器或者大分子；在小自噬过程中，溶酶体直；第３种溶酶体降解途径是ＣＭＡ，在ＣＭＡ中，胞质蛋运到溶酶体中进行降解（图１．２）。逡逑酶体还参与其它生命过程［２９］，如：参与分泌过程的调节，成有活性的甲状腺素［３（）］；精子的顶体形成，利用顶体于精子进入卵子，参与受精过程［３１］。逡逑凋ｔ逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96


本文编号：2661545