小分子表没食子儿茶素没食子酸酯激动OATP1B3的分子机制
发布时间：2020-05-13 19:14
【摘要】：有机阴离子转运多肽(Organic anion transporting polepeptides,OATPs)属于溶质转运体(Solute carrier,SLC)超家族,是一类重要的药物摄取转运体。按照氨基酸序列的同源性它们被分为6个亚家族。OATPs是一类多特异性的转运体,它们介导非钠离子依赖的广泛的两亲有机溶质的转运,包括胆汁盐、类花生酸、有机染料、甾体激素缀合物、甲状腺激许多药物和其他外源性物质。其中OATP1B1与OATP1B3是该类转运蛋白的重要成员,它们主要分布在人肝细胞膜的基底外侧膜上,在肝细胞的药物清除中发挥重要作用。OATP1B1与OATP1B3包含12个跨膜区,且两者的同源性高达80%,因此两者在结构与功能方面具有很大的相似性。其中雌酮-3-硫酸酯(Estrone-3-sulfate,E3S)是OATP1B1与OATP1B3共同的底物。然而当儿茶素类化合物表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)与 E3S 同时给药时,EGCG 能激动 OATP1B3对E3S的摄取,但是却抑制OATP1B1对E3S的摄取。有文献报道OATP1B3可被其他小分子激动,但对小分子激动OATP1B3的分子机制研究目前并没有文献报道。因此本论文的主要研究目标即是确定OATP1B3中哪些结构域和氨基酸残基对小分子的激动起重要作用,为此我们构建了 OATP1B3的12个嵌合蛋白,即OATP1B3的12个跨膜区域分别用OATP1B1对应的部分进行替换。功能研究结果表明,当OATP1B3的TM1和TM10被OATP1B1对应的部分替换时,小分子调节剂EGCG对OATP1B3的激动作用显著降低,甚至呈现抑制的趋势。以上结果表明,TM1与TM10这两个跨膜区是对小分子的激动起重要作用的结构域。将OATP1B1与OATP1B3在TM1的氨基酸序列进行比对发现,两者在TM1有五个氨基酸不同。为了进一步确定哪几个氨基酸是起主要作用的,我们将OATP1B3中的五个氨基酸残基分别突变为OATP1B1中对应的氨基酸残基,得到OATP1B3-F27L、F36L、Y38F、A42T和G45A五个单突变蛋白。功能研究表明,当OATP1B3在45位的氨基酸由柔性最大的甘氨酸突变成丙氨酸时,小分子调节剂EGCG对OATP1B3的激动作用显著降低。类似地,OATP1B3在TM10有14个氨基酸与OATP1B1不同,通过定点突变,我们得到了 14个单突变蛋白,分别为OATP1B3-N528D、T529A、F535Y、I536F、Y537F、I543L、S545L、L546F、T550L、T554S、F555H、I556V、L557M和T559I。功能实验表明,当OATP1B3在555位的氨基酸由芳香族苯丙氨酸突变成带正电荷的组氨酸时,激动作用显著降低。因此在野生型OATP1B3转运体中45位的甘氨酸以及555位的苯丙氨酸是对小分子EGCG的激动起主要作用的氨基酸残基。为了进一步将确定45和555位点氨基酸结构特征对OATP1B3激动的影响,我们将45位柔性最大的甘氨酸分别突变成含有羟基的丝氨酸、芳香族的苯丙氨酸、带负电的天冬氨酸、带正电的赖氨酸,得到1B3-G45S,1B3-G45F,1B3-G45D,1B3-G45K;同样类似地,将555位的苯丙氨酸突变成芳香族色氨酸与酪氨酸,得到1B3-F555W,1B3-F555Y。功能实验表明,当45位的甘氨酸突变成以上氨基酸时,小分子调节剂EGCG对OATP1B3的激动作用也是显著降低的,说明45位的甘氨酸柔性可能是发挥激动作用的关键因素。当555位芳香族的苯丙氨酸突变成带正电荷组氨酸时,EGCG对OATP1B3的激动显著降低,而当555位的苯丙氨酸突变成不带电荷的芳香族氨基酸色氨酸与酪氨酸时,EGCG对OATP1B3仍起激动作用。以上结果表明,555位的正电荷不利于OATP1B3的激动。
【图文】：
有组氨酸的氨基酸序列）的作用下合成片段２，新合成的片段１与片段２具有部分互逡逑补序列，最后在引物１与引物４的作用下，进行第二轮ＰＣＲ，，最终合成目的蛋白，逡逑原理如下图２－１所示。逡逑Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ邋ＰＣＲ逡逑Ｃｈｉｍｅｒａ邋１邋ｌ逦＾逡逑Ｐｎｍｅｒｌ＾邋ＯＡＴＰ１Ｂ１逦ＰｎｍｅｒＳ＾邋ＯＡＴＰ１Ｂ３逡逑Ｉ逦Ｉ逡逑４＾邋Ｐｒｉｒｎｅｒ２逦４１■卜逡逑；｜逦Ｐｒｉｍｅｒ邋４逡逑Ｉ邋Ｆｉｒｓｔ邋ｒｏｕｎｄ邋ＰＣＲ逡逑Ｐｒｉｍｅｒ邋１邋ｃｚｊ＞逦%煎义稀稿危簦殄鍉栧澹殄义暇礤澹校颍椋恚澹蝈澹村义希樱澹悖铮睿溴澹颍铮酰睿溴澹校茫义义希殄危义希茫瑁椋恚澹颍徨澹卞义贤迹玻保氐校茫业脑硗煎义希疲椋纾澹玻保澹裕瑁邋澹穑颍椋睿悖椋穑欤邋澹铮驽澹铮觯澹颍欤幔穑穑椋睿珏澹校茫遥义先缓蠼菇ê玫哪康幕蛟冢模危亮用傅淖饔孟虏迦耄穑悖模危粒担疲遥缘目瞻自靥邋义希峰义
本文编号：2662414
【图文】：
有组氨酸的氨基酸序列）的作用下合成片段２，新合成的片段１与片段２具有部分互逡逑补序列，最后在引物１与引物４的作用下，进行第二轮ＰＣＲ，，最终合成目的蛋白，逡逑原理如下图２－１所示。逡逑Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ邋ＰＣＲ逡逑Ｃｈｉｍｅｒａ邋１邋ｌ逦＾逡逑Ｐｎｍｅｒｌ＾邋ＯＡＴＰ１Ｂ１逦ＰｎｍｅｒＳ＾邋ＯＡＴＰ１Ｂ３逡逑Ｉ逦Ｉ逡逑４＾邋Ｐｒｉｒｎｅｒ２逦４１■卜逡逑；｜逦Ｐｒｉｍｅｒ邋４逡逑Ｉ邋Ｆｉｒｓｔ邋ｒｏｕｎｄ邋ＰＣＲ逡逑Ｐｒｉｍｅｒ邋１邋ｃｚｊ＞逦%煎义稀稿危簦殄鍉栧澹殄义暇礤澹校颍椋恚澹蝈澹村义希樱澹悖铮睿溴澹颍铮酰睿溴澹校茫义义希殄危义希茫瑁椋恚澹颍徨澹卞义贤迹玻保氐校茫业脑硗煎义希疲椋纾澹玻保澹裕瑁邋澹穑颍椋睿悖椋穑欤邋澹铮驽澹铮觯澹颍欤幔穑穑椋睿珏澹校茫遥义先缓蠼菇ê玫哪康幕蛟冢模危亮用傅淖饔孟虏迦耄穑悖模危粒担疲遥缘目瞻自靥邋义希峰义
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