功能性修饰糖脂纳米给药系统线粒体靶向与敏感释放的抗肿瘤研究

发布时间：2020-05-14 21:01

【摘要】：线粒体是诱导肿瘤细胞凋亡的重要靶点。通过给药系统载体的主动靶向修饰,可实现靶向线粒体的药物高效递送,最大限度降低脱靶效应,实现药物的高效低毒治疗。本研究致力于利用肿瘤细胞线粒体的特殊病理内环境特性,以及采用外源性刺激等方式,设计智能化纳米给药系统实现线粒体高效靶向及敏感释放。选用可生物降解海洋生物材料阳离子壳聚糖(Chitosan,CSO)为基本骨架,嫁接亲脂性硬脂酸(Stearic acid,SA),构建阳离子壳聚糖硬脂酸嫁接物(Stearic acid grafted chitosan,CSOSA),进行亲脂性阳离子四羧丁基三苯基膦((4-carboxybutyl)triphenylphosphonium bromide,CTPP)化学修饰,得到CTPP修饰CSOSA嫁接物(CTPP modified stearic acid-g-chitosan,C-P-CSOSA)。优选CTPP修饰比例为3.88%的C-P-CSOSA,该嫁接物可在水中自聚集形成胶束,且具有较强的质子缓冲能力。细胞摄取研究结果显示,MMF-7肿瘤细胞的的-P--SOSA摄取,明显高于于正肝L02细胞。。TPP主动靶向修饰,可进嫁接物物束更多地经内在化进进肿瘤胞,从溶酶体中快速逃逸,靶向肿瘤细胞线粒体。以阿霉素(Dooorubicin,DOXX为模型药物,透析法制备线粒体靶向给药系统统-P-SOSA/DOXX经测定,,-P--SOSA/DOX粒径径为67.222.82 nm,表面电位位18.7±1.78mV。-P--SOSAADOX的肿瘤细胞毒性,明显高于游离DOX及及SOSA/DOX,其作用机理主要与激活线粒体信号通路,诱导肿瘤细胞凋亡有关。MMF-7荷瘤裸鼠为动物模型,体内分布研究结果显示,,TPP修饰可增强嫁接物胶束的肿瘤组织聚集。体内药效学结果显示,C-P-CSOSA/DOX的抑瘤率为75.0%,显著高于CSOSA/DOX的抑瘤率44.8%和游离DOX·HC1的抑瘤率55.0%。利用肿瘤细胞线粒体弱碱性pH内环境的特点,设计线粒体内环境响应释放给药系统。以弱酸性药物雷公藤红素(Celastrol,Cela)为模型药物,透析法制备线粒体弱碱性敏感释放给药系统C-P-CSOSA/Cela。经测定,C-P-CSOSA/Cela粒径为63.5±18.0 nm,表面电位为22.1±0.3 mV。C-P-CSOSA/Cela在模拟线粒体弱碱性环境pH 8.0 PBS释放介质中呈现快速药物释放行为,12 h累积释放百分率为80.7%,显著高于C-P-CSOSA/Cela在模拟胞浆pH 7.4和溶酶体pH 5.0 PBS中12 h的药物累积释放百分率。经测定,Cela在pH 8.0 PBS的溶解度为21.1±0.38 μg/mL,是pH 7.4 PBS溶解度的3.73倍。Cela 在pH 5.0 PBS 中不溶解。Cela在pH 8.0 PBS中较高的溶解度,促使疏水性Cela与胶束疏水内核相互作用力减弱,促进Cela从嫁接物胶束快速释放。研究结果表明C-P-CSOSA/Cela可响应线粒体弱碱性pH环境快速释放Cela,提高线粒体内Cela浓度,同时减少Cela在胞浆和溶酶体的泄漏。C-P-CSOSA/Cela与MCF细胞共孵育,线粒体明显肿胀,嵴开始破裂退化,线粒体损伤较严重,显示C-P-CSOSA/Cela具有促肿瘤细胞早期凋亡能力,明显强于CSOSA/Cela和游离Cela。研究结果揭示,C-P-CSOSA/Cela可刺激ROS水平快速增加,引起线粒体膜电位降低,促进细胞色素C释放至胞浆,诱导Caspase级联反应,促进肿瘤细胞凋亡。以MCF-7荷瘤裸鼠为动物模型,研究结果证实C-P-CSOSA具有较好的肿瘤细胞线粒体靶向性,C-P-CSOSA/Cela的抑瘤率为80.2%,显著高于CSOSA/Cela的抑瘤率58.4%和游离Cela的抑瘤率54.9%,通过响应线粒体内环境弱碱性pH的药物敏感释放,大幅度提高抗肿瘤疗效,为肿瘤给药系统设计提供探索性新思路。采用外源性光热刺激策略,设计线粒体靶向的药物敏感释放给药系统。选择近红外(NIR)荧光探针亲脂性阳离子IR780碘化物(IR780)修饰CSOSA嫁接物,DOX为模型药物,透析法制备线粒体靶向的光热敏感释放给药系统IR780-CSOSA/DOX。研究结果显示,IR780-CSOSA嫁接物的IR780修饰比例为3.12%,该嫁接物在795 nm处有较强吸收,与IR780的吸收特性基本一致,表明IR780-CSOSA具备良好的近红外吸收特性。光热转换能力研究结果显示,IR780-CSOSA具有较好的光热转换效率,并通过减缓IR780降解来保持良好的光热稳定性。经测定,IR780-CSOSA/DOX粒径为119.0±7.6 nm,表面电位为37.8±0.9 mV。IR780-CSOSA/DOX在NIR激光照射下呈现快速药物释放行为,10 h累积释放百分率为63.0%,48h累积释放百分率为82.3%。研究发现,光热效应产生的过高热,可促使DOX溶解度明显增加,削弱药物与胶束内核的相互作用力,导致IR780-CSOSA/DOX载药纳米粒结构发生膨胀,粒径增大,促进DOX从胶束中快速释放。研究结果发现,IR780-CSOSA/DOX可选择性聚集于肿瘤细胞线粒体,通过响应NIR激光照射,诱导产生的过高热触发DOX在线粒体内快速释放,同时,过高热刺激线粒体,联合诱导ROS水平大幅度提高,导致大量细胞色素C释放至胞浆,诱导Caspase 9/3级联反应,引起肿瘤细胞凋亡显著性增加。IR780-CSOSA/DOX靶向分布到肿瘤组织后,经NIR激光照射,肿瘤区域温度快速升高,过高热可促进IR780-CSOSA/DOX更多地渗透到肿瘤深部。线粒体光热敏感释放给药系统IR780-CSOSA/DOX抑瘤率为85.3%,显著高于单独化疗组DOX·HCl的抑瘤率55.0%和单独热疗组IR780-CSOSA的抑瘤率54.7%。研究结果揭示,IR780-CSOSA/DOX激光照射后肿瘤组织HSP70表达明显上调,证实热效应显著;Cleaved Caspase 3及CD8表达水平显著提高,表明肿瘤细胞出现明显凋亡,释放大量肿瘤抗原,可募集更多的CD8阳性T细胞到达肿瘤组织,激活机体免疫应答;Ki67阳性细胞比例及CD31表达水平大幅度降低,表明肿瘤细胞增殖及血管生成受到明显抑制。
【图文】：

液调节至ｐＨ邋＝１０，搅拌下滴加０．１邋ｍｏｌ／ＬＨＣｌ溶液进行滴定溶液ｐＨ从１０到３的变化过程，实时记录溶液ｐＨ值及的体积。以ＮａＯＨ水溶液（ｐＨ＝邋１０）为空白对照，测定Ｃ质子缓冲能力。逡逑论逡逑脂酸糖脂嫁接物合成逡逑法制备低分子量壳聚糖，凝胶色谱法测定其分子量为２０邋ｙｔ选择性断裂壳聚糖Ｐ－（ｌ，邋４）－糖苷键［３８，３９１碳二亚胺作为硬脂酸分子结构中的羧基，形成０－酰基异脲，与壳聚水反应，得两亲性壳聚糖硬脂酸嫁接物（ＣＳＯＳＡ），，化

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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943

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本文编号：2663931