ATR抑制剂的计算机辅助设计与抗肿瘤活性研究

发布时间：2020-05-14 17:49

【摘要】：共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶(Ataxia Telangiectasia and Rad3-related,ATR)是DNA损伤修复机制中的关键激酶,不仅能够在DNA损伤后激活细胞应答阻滞细胞周期进程并稳定复制叉,还能修复DNA,从而避免细胞凋亡。抑制ATR可以使肿瘤细胞中受损伤的DNA因得不到修复而凋亡,而正常细胞因存在多种DNA损伤修复机制且能相互补偿而影响较小,因此ATR是理想的抗肿瘤靶点。目前,已报道的ATR抑制剂较少,可用资源有限。为开发高活性、高选择性的新型的ATR抑制剂,为肿瘤的临床治疗提供更多的候选药物选择,本研究以ATR为靶点,使用计算机辅助药物设计技术,设计、筛选并合成了两个具有良好抗肿瘤活性的抑制剂。主要分为以下五部分:1.综述本章总结了ATR及ATR抑制剂的抗肿瘤应用,和常见的计算机药物开发技术的研究进展。首先介绍了ATR的结构和功能及其在DNA损伤修复通路中的作用,和作为抗肿瘤靶点的有效性验证。其次回顾并总结了目前存在的ATR抑制剂及其在抗肿瘤的应用,最后介绍了计算机药物开发技术在抗肿瘤药物开发中的研究进展。为后续的研究提供了理论和技术支撑。2.基于药效团模型与分子片段法的ATR抑制剂的设计本章旨在通过药效团模型和分子片段法设计新型ATR抑制剂。首先通过已知的结构多样的28个ATR抑制剂构建了5个配体药效团模型,根据300个已知的ATR抑制剂对药效团模型的有效性进行评价,选出准确率最高的药效团模型(LB-2)。其次根据LB-2模型提取140个ATR抑制剂(IC_(50)20nM)得到了42个药效特征基团,并使用分子对接技术对其与ATR的相互作用进一步评价后,最终得到29个与ATR抑制剂活性相关的药效特征基团。最后,以得到的药效特征基团和已知的70个ATR抑制剂(IC_(50)10nM)为基础,使用分子片段法设计得到125个全新的化合物。3.ATR抑制剂的评价本章通过构建基于SVM的ATR抑制剂预测模型和分子对接模型对本研究设计的125个化合物成为ATR抑制剂的可能性进行评价,筛选有希望的化合物。首先从BindingDB数据库和ZINC数据库里选取了700个化合物(包括400个阴性化合物和300个阳性化合物)作为训练集,188个化合物(包括100个阴性化合物和88个阳性化合物)作为测试集,并选择94个与ATR抑制剂活性相关性较大的描述符用于化合物结构表征。使用训练集对模型参数进行考察后选取了7-Fold、c-SVC、RBF核函数为参数构建了ATR抑制剂SVM预测模型(SVM-ATR),其SE为99%,SP为90.91%,ACC为95.21%,MCC为90.59%。在此基础上,进一步使用网格搜索算法对SVM-ATR模型进行优化,确定模型参数c,g分别为1.4142,1.4142,交叉验证准确率达到95.5714%,最终优化后预测模型(GS-SVM-ATR)的SE为100%,SP为90.91%,ACC为95.74%,MCC为89.76%。所设计的125个化合物经GS-SVM-ATR模型评价后得到66个可能具有ATR抑制活性的化合物。最后通过参考化合物AZD6738(已进入临床试验研究的ATR抑制剂)与ATR蛋白的对接模型,进一步评价66个化合物与ATR的结合,结果显示化合物51、52与ATR能稳定结合,且相互作用残基与AZD6738对接模型基本一致。表明化合物51、52有望成为有效的ATR抑制剂。4.ATR抑制剂的合成本章旨在合成出化合物51、52,为后续研究提供基础。首先通过逆合成分析确定了化合物51、52的合成路线。其次根据化合物51、52的合成路线,合成了化合物51、52。最后经过氢谱、碳谱及质谱分析,本研究合成的化合物51和52结构正确,可用于后续研究。5.ATR抑制剂的抗肿瘤活性研究本章旨在研究化合物51、52的抗肿瘤活性及其可能的作用机制。以乳腺癌细胞(MCF-7)为模型,通过化合物51、52单独、以及与阿霉素联合使用考察化合物51、52的抗肿瘤活性,并对可能的作用机制进行推测。结果显示化合物51、52对MCF-7细胞的IC_(50)分别为496?M、451?M,有一定的抗肿瘤活性,但是抗肿瘤效果不明显。但化合物51、52与阿霉素联合使用时IC_(50)显著低于阿霉素(30.368?M),分别为18.632?M和12?M,化合物51与阿霉素的协同作用CI=0.6511,为中度协同作用,化合物52与阿霉素的协同作用CI=0.4217,为高度协同作用。不同组合试验表明化合物51、52可能的抗肿瘤机制为通过抑制处于DNA损伤状态的细胞的增殖而达到抗肿瘤的效果,与ATR抑制剂作用机制相吻合。化合物51、52与阿霉素的最佳协同作用试验结果显示,其最佳比例分别为3.5:1和3:1,抑制MCF-7细胞的IC_(50)分别为13?M和7?M,具有显著优于阿霉素的抗肿瘤效果。综上所述,本研究通过构建ATR抑制剂药效团模型、分子对接模型、SVM预测模型以及分子片段法设计、筛选并合成出两个有望成为ATR抑制剂的新化合物,并通过细胞实验证实了其抗肿瘤活性,并对其作用机制进行了初步推测。本研究的结果将为新型ATR抑制剂的筛选以及其它小分子靶向药物的开发提供方法借鉴,同时,也有望为肿瘤的临床治疗提供新的选择。
【图文】：

结构域,激酶结构域

药物开发技术在抗肿瘤药物开发中的应用。为后续的研究提供了理论和技术支撑。1.1 ATR 及其生理功能1.1.1ATR 的结构ATR 是磷脂酰肌醇 3-激酶相关激酶（Phosphatidylinositol3-Kinase RelatedKinase；PIKK）家族的成员，主要由三部分构成，一共包含 2644 个氨基酸[1]（图1.1）：第一部分是在 N-末端区域由 HEAT 重复组成的 ATRIP 相互作用域，是ATR 被激活的重要结构域；第二部分是 FAT 结构域，由在 PIKK 家族中高度保守的螺旋 HEAT 重复组成，为激酶结构域提供结构支持；第三部分是激酶结构域，该激酶结构域包括负责 TOPBP1 和 FATC 结构域结合的 PIKK 调控结构域[2]。

DNA损伤,复制叉,基因组不稳定性,复合物

ATR 抑制剂的计算机辅助设计与抗肿瘤活性研究被激活的途径是复制蛋白 A（Repair Protein A ，RPA）快速结合单链 DNA（ssDNA），而 ATRIP（ATR-Interacting Protein）与 ATR 形成复合物后与 RPA包被的 ssDNA 结合，并将 ATR 募集到 DNA 损伤位点。Rad17 通过结合 RPA 包被的 ssDNA，，并反过来募集 9-1-1 复合物和 TopBP1，并刺激 ATR 蛋白激酶活性。ATR 还通过激活 Chk1（checkpoint kinase 1）来诱导 S 和 G2/M 期的细胞周期停滞来促进 DNA 修复，以防止 DNA 损伤的细胞进入有丝分裂[8]。ATR 可以稳定复制叉进程防止 DNA 双链断裂，还有助于重新启动停滞的复制分支，ATR 的抑制或丧失会导致因无法解决停滞的复制叉、减慢复制叉进展和 DNA 损伤积累，而导致基因组不稳定性或细胞死亡[9]。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96;TQ460.1;TQ015.9

【参考文献】