苔类植物苯丙素生物合成关键酶功能及双联苄生物合成调控机制研究

发布时间：2020-05-16 16:06

【摘要】：苔藓(包括苔纲、藓纲、角苔纲)处于植物由水生向陆生过渡的阶段,是最早的陆生植物;它在进化分类上介于藻类和维管植物之间,也是最低等的高等植物。苔藓能产生大量的次级代谢产物,尤其是苔类植物,几乎所有的苔类细胞中都存在油体,其中含有异常丰富的萜类及芳香类化合物。这些成分不仅结构多样,而且具有广泛的生物学活性,诸如抗细菌、抗真菌、抗氧化、杀虫等等。基于其特殊的进化地位以及富含结构独特且生物活性多样的次级代谢产物,苔类植物值得被深入研究。相比苔藓植物化学的飞速发展,其生物学方面的研究就显得相对落后,所以本文从分子生物学的角度,以基因克隆、代谢工程为手段,对苔类植物次级代谢途径上的关键酶以及重要次级代谢产物的合成调控机制进行了研究,一方面可以从微观角度阐明苔类植物的起源进化,另一方面也能为用生物手段提高生物活性成分的含量奠定理论基础。苔类植物富含芳香化合物,其中包括苔类所特有的结构独特的大环双联苄类,这些化合物拥有良好的生物学活性。前人通过同位素追踪法,推测出双联苄类化合物与高等植物中的黄酮均来自苯丙素和聚酮生物合成途径,它们共用一套酶体系。bHLH转录因子参与调控植物体内多种重要生物学过程,尤其是Ⅲf亚类在高等植物中能调节黄酮类的生物合成。由此推断,Ⅲf亚类的bHLH转录因子在苔类中可能参与调控双联苄类的生物合成。前期实验从钝鳞紫背苔中克隆得到一个bHLH转录因子PabHLH,并通过转化钝鳞紫背苔的愈伤组织,初步证明其可能对双联苄类化合物在苔中的积累有调控作用。本文研究发现钝鳞紫背苔三种不同组织中双联苄类成分的含量与其中的PabHLH基因表达水平呈正相关。高等植物bHLH会对外界压力产生转录应激,当对钝鳞紫背苔材料施加外源激素SA或者MeJA时也会诱导PabHLH的强烈表达。序列比对显示,PabHLH虽与高等植物bHLH的相似度很低,但是它仍具有保守的bHLH区域,并且在进化树分析时,PabHLH与高等植物的Ⅲf亚类bHLH转录因子聚为一簇。用前期构建的PabHLH植物过表达以及RNAi载体稳定转化钝鳞紫背苔的叶状体组织,对转基因植物的化学成分进行检测。叶状体中主要的双联苄成分片叶苔素D(RD)在过表达克隆中产量增加,在RNAi克隆中产量降低。这一结果也与转基因叶状体粗提物对白色念珠菌菌丝形成抑制实验的现象相对应;同样地,叶状体中的总黄酮成分在过表达克隆中积累,在RNAi克隆中减少。分析转基因愈伤以及叶状体克隆中双联苄及黄酮生物合成通路上各结构基因的表达水平,结果显示,PabHLH在苔类植物中通过影响PAL、4CL1、STCS1、CHS、P450-3、P450-4、CHS以及FNSI的表达来实现对双联苄以及黄酮含量的调控。在应对恶劣环境时,除了合成生物活性分子,苔藓植物还发展了自己的抗氧化、脱毒机制。α,β-不饱和双键还原酶能高效地催化还原脂质过氧化产生的具有细胞毒性的产物。所以α,β-不饱和醛酮双键还原酶在抗氧化、脱毒方面发挥了重要作用。本文从粗裂地钱转录组数据库中发现两个注释为α,β-不饱和双键还原酶的序列,分别命名为MpDBR1和MpDBR2,通过3'-RACE、5'-RACE及其它克隆手段得到两个基因的全长克隆。序列比对发现MpDBR1和MpDBR2都具有中链脱氢酶/还原酶(MDR)家族的AXXGXXG和GXXS保守域,但是它们两个的整体相似度却较低。进化树分析也显示MpDBR1和MpDBR2归属于不同的进化分支,MpDBR1与其它植物中已鉴定的双键还原酶归于一类,而MpDBR2则与真菌中的双键还原酶亲缘关系较近,这类双键还原酶从未在其它植物中发现过。分别构建了 MpDBR1和MpDBR2的原核表达载体,表达蛋白并纯化,进行体外酶活功能以及酶学特性的分析。结果显示,它们均具有氢化还原α,β-不饱和双键的功能,但是它们的酶学特性却存在差异,MpDBR1的最适温度和最适pH为37℃和6.5,MpDBR2的却为20℃和7,MpDBR2对温度尤其敏感。阐明了苔类植物中至少存在两个亚类的双键还原酶,也揭示了苔类植物中基因的多样性。为了适应由水生环境向陆生环境过渡的需要,苔藓植物在其生理方面发生了相应的变化。自然界中木质素的出现被认为是植物由水生向陆生生活方式转变的关键因素。尽管木质素是否真正存在仍然有争议,但现在普遍认为苔藓中包含“不凝聚”的木质素单体类分子,同时木脂素成分也在苔藓中被分离得到。羟基肉桂酰辅酶A莽草酸/奎尼酸羟基肉桂酰转移酶(HCT)在高等植物中参与木质素木脂素单体分子的生物合成,但是HCT在苔类中的功能还未被研究过。本文从粗裂地钱和钝鳞紫背苔的转录组数据库中筛选到了两个注释为羟基肉桂酰转移酶的基因,分别克隆并命名为MpHCT和PaHCT。与其它高等植物已鉴定的HCT进行序列比对,发现MpHCT和PaHCT均具有BAHD转移酶家族的特征性保守区域,HXXXD和DFGWG;并且和其它HCT具有很高的相似性,除了 MpHCT和PaHCT序列的中间位置比高等植物HCT长了100个氨基酸的片段。进化树分析表明,MpHCT和PaHCT处于较古老的进化地位,并且与小立碗藓中的PpHCT具有最近的亲缘关系,其次是江南卷柏中的SmHCT。构建截短体MpHCT-Tr、PaHCT-Tr,与真实的序列较短的SmHCT一起,对MpHCT和PaHCT中长出片段的功能作用进行研究。体外酶活结果显示,无论是比活性还是酶学动力学分析,长的HCT与短的HCT所表现出来的底物选择性是一致的,它们都能接受对羟基肉桂酰CoA、咖啡酰CoA、阿魏酰CoA作为酰基供体,莽草酸、奎尼酸作为酰基受体,并且对羟基肉桂酰CoA和莽草酸是它们的最适底物;同时,它们对底物的催化效率也都是类似的。全长HCT与截短HCT体内瞬时转化烟草细胞,结果显示两者均能使烟草叶片中绿原酸和隐绿原酸总量增加;而它们在钝鳞紫背苔叶状体中的稳定转化,也显示出全长HCT与截短HCT均能引起苔类植物中类木质素样成分的积累。综上说明,苔类植物HCT基因中长出的一段序列并不参与酶的功能催化。构建MpHCT、PaHCT、MpHCT-Tr、PaHCT-Tr和SmHCT的亚细胞定位载体,分别转化烟草叶片观察,三个短的HCT同时定位于细胞质和细胞核,两个长的HCT只定位于细胞质。实验表明,苔类植物中存在真正的功能性HCT基因,它较高等植物HCT长出的一段基因序列与它的亚细胞定位有关。
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逦Ｐｅｒｒｏｔｔｅｔｉｎ邋Ｅ．邋８逦２邋ｘ邋Ｌｕｎｕｌａｒｉｎ，，邋９逡逑图１．１大环双联苄的主要结构类型［１６］逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｇｅｎｅｒａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ邋ｂｉｓｂｉｂｅｎｚｙｌ邋ｎａｔｕｒａｌ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ．逡逑迄今为止已经从苔类植物中发现了一百多种大环双联苄。一般来说氧化偶联逡逑作用会降低抗真菌剂的作用但是大环双联苄却比它相应单体的抗真菌活性更逡逑强。例如，羽苔素Ｅ对白色念珠菌比半月苔素展现出更强的抗真菌活性，它们逡逑的ＭＩＣ值分别是１６和６４邋ｐｇ／ｍＵ１７］。地钱素Ａ，作为第一个从自然界发现的大逡逑１４逡逑

逡逑个螺旋的位置（图１．４）。碱性区域包含１５－１７个氨基酸，它们与ＤＮＡ的结合有逡逑关。拟南芥中２０％的ｂＨＬＨ转录因子因为缺乏这个碱性区域，形成异源二聚体逡逑而无法结合ＤＮＡ，从而发挥抑制作用［４９］。逡逑ｂＨＬＨ蛋白能结合典型的顺式元件Ｅ－ｂｏｘ（５’－ＣＡＮＮＴＧ－３’），变异型的Ｇ－ｂｏｘ逡逑（５’－ＣＡＣＧＴＧ－３’）是它最常识别的序列。拟南芥中，两个碱性区域的氨基酸Ｇｌｕｌ３逡逑和Ａｒｇｌ６形成Ｅ－ｂｏｘ识别区域，从而发挥ＤＮＡ结合作用＿。事实上，Ｇｌｕｌ３直逡逑接与Ｅ－ｂｏｘ中的ＣＡ碱基结合，而Ａｒｇｌ６则是辅助Ｇｌｕｌ３的结合与维持稳定。对逡逑于Ｇ－ｂｏｘ的结合，则是通过Ｈｉｓ／Ｌｙｓ９，ＧｌｕＩ３和Ａｒｇｌ７，即ＨＥＲ区域来完成的。逡逑Ａｒｇｌ７与内侧的碱基Ｇ结合
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R914


本文编号：2666988