基于金纳米棒的多功能纳米材料用于逆转耐药结肠癌的研究

发布时间：2020-05-16 18:43

【摘要】：目的:结直肠癌症(CRC)化疗成功与否的主要障碍是其容易产生多药耐药性(MDR),即癌细胞表现出交叉耐药的现象。光热治疗对于耐药肿瘤治疗具有重要的应用前景。金纳米棒(GNRs)在近红外区(NIR)具有非常高的光热转换效率,是一种很有前景的光热治疗材料。但是,单独的光热治疗会引起肿瘤转移和复发。为了解决以上问题,本课题拟构建一种以GNRs为内核的新型多功能纳米给药系统(DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS),包载抗癌药物阿霉素(DOX),修饰以聚组氨酸(PHIS),使其具有pH响应性并实现溶酶体逃逸,表面修饰以聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)用来抑制P-糖蛋白并诱导细胞凋亡。相比单纯的化疗或光热治疗,该金纳米棒复合物用于耐药结肠癌的光热-化疗联合治疗,有望获得更好的治疗效果,并可以降低全身毒性。内容:以GNRs为内核,介孔二氧化硅包覆GNRs(GNRs@mSiO_2)使其能够包载用于光热-化疗联合治疗的抗肿瘤药物DOX。其次为了逆转对DOX的耐药性,将pH响应性的PHIS化学键合在GNRs@mSiO_2表面上,通过有效的内涵体/溶酶体逃逸增加药物在耐药肿瘤细胞内的累积。最后将TPGS通过疏水作用组装在该金纳米棒复合物表面,不仅能增加其稳定性和诱导细胞凋亡,还能通过抑制P-糖蛋白实现对药物外排的抑制,进而增加药物在细胞内的累积。通过透射电子显微镜镜(TEM)、紫外-可见-近红外吸收光谱仪(UV-Vis-NIR)、傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR)和Zeta电位的表征,证实了该金纳米棒复合物的形貌和结构。评估了该金纳米棒复合物的性质,包括光热稳定性、光热转换效率、pH响应性和体外药物释放性能。以耐药的SW620/Ad300细胞为模型,进一步研究该金纳米棒复合物在细胞内的作用机制和细胞毒性。最后通过体内实验评价了该金纳米棒复合物的光热转化效率、抗肿瘤效果和全身毒性。方法:金纳米棒复合物的制备:首先利用种子介导生长法制备出GNRs;其次利用溶胶凝胶法用正硅酸乙酯(TEOS)在GNRs表面包覆介孔二氧化硅;接着利用相同的方法在GNRs@mSiO_2表面上修饰3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),引入氨基;然后利用酰胺化反应在GNRs@mSiO_2-NH_2表面化学键合上PHIS,制得GNRs@mSiO_2@PHIS;最后利用疏水的相互作用在GNRs@mSiO_2@PHIS表面组装上TPGS,制备得到GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS及其载药制剂DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS。金纳米棒复合物的体外表征:利用TEM表征GNRs的形貌、包覆不同涂层后复合物的形貌、长短径大小以及分散状态。采用FT-IR光谱表征其表面官能团的变化,并利用激光粒度仪,采用动态光散射法(DLS)测定各步所得产物的Zeta电位。利用UV-Vis-NIR光谱表征其等离子共振吸收峰的位移变化,并表征其在NIR激光照射后的等离子共振吸收峰的变化,接着利用红外热成像仪来考察其光热转换效率。通过紫外分光光度法测定其载药量,并在不同pH下检测其Zeta电位变化来考察其pH敏感性,接着对其在体外pH 9.0、6.5和5.0的条件下进行释药行为的考察,并在pH 5.0的条件下考察NIR激光照射对药物释放的影响。金纳米棒复合物在细胞水平上的评价:在细胞水平上利用MTT法考察SW620/Ad300细胞的耐药指数,以及不同的NIR激光照射时间对其生存率的影响,接着考察不同的金纳米棒复合物对SW620/Ad300细胞的生长抑制作用,并计算其半数抑制浓度值(IC_(50))以及逆转指数(RI)。采用活死细胞染色实验进一步验证光热-化疗联合治疗的作用。采用激光共聚焦荧光显微镜(CLSM)监测SW620/Ad300细胞对游离DOX和DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS的摄取性能,并进一步验证内涵体/溶酶体逃逸性能;接着利用流式细胞仪定量检测SW620/Ad300细胞在pH 6.8的条件下对游离DOX和DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS的摄取量,并分别考察了两种情况在2 h的药物外排时间下的摄取量。初步评价了光热-化疗联合治疗的作用以及DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS在SW620/AD300细胞内的作用机制。金纳米棒复合物在动物水平上的评价:在人源耐药结肠癌SW620/Ad300的裸鼠肿瘤异种移植模型上考察金纳米棒复合物在肿瘤内部的光热转换效率;通过药效学实验评价了该金纳米棒复合物的抗肿瘤效果,其中通过肿瘤体积大小的变化以及瘤块大小的解剖图来评价其抗癌疗效;通过裸鼠相对体重变化以及裸鼠主要脏器(心、肝、脾、肺和肾)的HE染色进行初步毒性评价。结果:TEM图、FT-IR光谱图、Zeta电位变化、UV-vis-NIR光谱图的结果均表明成功制备出结构均一、分散性良好且具有一定长径比的DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS金纳米棒复合物。TEM图可见其呈棒状分布,mSiO_2层的厚度为20.1±2.5 nm,mSiO_2@PHIS层的厚度为21.7±1.9 nm,mSiO_2@PHIS@TPGS层的厚度为24.8±2.2 nm。金纳米棒复合物具有良好的光热稳定性和光热转换效率,808 nmNIR激光照射金纳米棒复合物1 h前后的UV-Vis-NIR光谱图没有发生变化;当金纳米棒复合物浓度为22μg/mL时,在2.5 W/cm~2的功率条件下NIR激光照射5 min后溶液温度可达到43℃。该金纳米棒复合物随着pH值降低,Zeta电位值逐渐由负变为正,且在pH 6.0-6.5之间产生Zeta电位翻转现象。药物释放实验表明该金纳米棒复合物在pH 5.0条件下8天内累积释放量约达到66.1%,在pH 6.5时约为42.6%,而在pH 9.0时仅约为18.9%;在NIR激光激发药物释放实验中,在pH 5.0条件下NIR激光照射后发现明显的药物突释。在体外逆转多药耐药研究中,MTT实验结果表明所采用的SW620/Ad300细胞对DOX的耐药指数为175.5;所采用的NIR激光照射强度对细胞生存率几乎没有影响;TPGS具有一定的抗癌效果;相比于单独的光热治疗或化疗,基于金纳米棒复合物的光热-化疗联合治疗具有更好的抗癌效果,并且成功逆转SW620/Ad300细胞的多药耐药性,逆转指数为97.52。体外的活死细胞染色实验又进一步证实了光热-化疗联合治疗具有更好的抗癌效果。在细胞摄取实验的研究中,实验结果证明随着给药孵育时间的延长,金纳米棒复合物组中DOX在细胞内水平一直在增加,且在4 h时部分DOX分布在细胞核中,游离DOX组中DOX在细胞内水平一直保持低水平且没有进入细胞核,流式细胞术结果证明,4 h时金纳米棒复合物组中DOX在细胞内水平是游离DOX组的2.3倍。金纳米棒复合物组中DOX和内涵体/溶酶体区室(黄色)的共定位在前2 h是明显的,4 h时在溶酶体区室观察到小部分DOX,而大部分DOX被释放到细胞质中并进入细胞核,证明了该金纳米棒复合物具有内涵体/溶酶体逃逸的性质。在流式细胞术进行药物外排实验时,金纳米棒复合物组的细胞内DOX水平未显示出显著变化,而游离DOX组的细胞内DOX水平下降至原来水平的51.4%,证明金纳米棒复合物能抑制MDR肿瘤细胞的药物外排作用。以上结果均表明金纳米棒复合物可以依赖于有效的细胞内递送和减少药物外排来进一步显著增加DOX在细胞内的累积以逆转MDR。在动物水平上的研究中,为了评价金纳米棒复合物在SW620/Ad300肿瘤异种移植模型荷瘤裸鼠中瘤内的光热转换效率,利用808 nm NIR激光(1.3 W/cm~2)照射肿瘤区域2 min后发现PBS组仅显示轻微的温度升高,金纳米棒复合物组温度快速升至54.5±0.6℃。在体内药效学实验可见,不同的治疗对肿瘤抑制能力依次为:DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS with irradiation组GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS with irradiation组DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS组游离DOX组PBS组。金纳米棒复合物的初步毒性考察结果显示,所有组裸鼠体重没有显著降低,证明金纳米棒复合物的全身毒性很小;裸鼠的心、肝、脾、肺和肾等主要器官的HE染色结果表面,所有组中裸鼠的主要器官均没有发现损伤。总之,体内实验证明金纳米棒复合物对耐药结肠癌具有有效的光热-化疗联合治疗效果,几乎没有全身毒性。结论:本研究成功制备得到的DOX-loaded GNRs@mSiO_2@PHIS@TPGS金纳米棒复合物,分散均一,结构稳定,具有良好的光热转换效率,同时具有pH响应性和NIR激光激发的药物释放性能。相比于单独的光热治疗或化疗,基于该金纳米棒复合物的光热-化疗联合治疗在耐药结肠癌模型上呈现出更强的细胞增殖抑制能力、细胞摄取能力、抗肿瘤疗效和较小的毒副作用。因此,该金纳米棒复合物有望成为新一代光热治疗和化疗协同逆转耐药癌症的极具潜力的新型纳米给药系统。
【图文】：

路线图,路线图,复合物,溶液

图 1-1 金纳米棒复合物的制备路线图1.2.1.1 GNRs 的制备在 10 mL 西令瓶中，加入 5 mL0.5 mM HAuCl4，在 1100 rpm 的转速下，加入 5 mL0.2 M CTAB，迅速加入用冰水配制的 0.01 M NaBH40.6 mL，30 ℃水浴下搅拌 2 min，可以看到溶液由黄色变为茶色。将种子溶液放入 30 ℃水浴锅中保存待用。其次，将种子溶液加入生长溶液，通过随机“爆米花”机制制备 GNR[28]。在 250 mL 三颈瓶中，加入 5.0 mL0.004 MAgNO3，再加入 100 mL 保存于30 ℃水浴锅中的 0.2 M CTAB，在 500 rpm 的转速下，30 ℃水浴中加入 100 m0.001 M HAuCl4，，搅拌 6 min 后，避光，滴加 1.5 mL0.0788 MAA，继续搅拌 4 mi配成无色的生长溶液。静置15 min后的生长溶液在500 rpm的转速下加入240 μ种子溶液，10-20 min 变成砖红色停止搅拌。静置 4-6 h 后，用超纯水离心洗涤次后复分散在 14 mL 水中，得到 GNRs。1.2.1.2 GNRs@mSiO2的制备在 100 mL 斜形瓶中加入用超纯水稀释至 40 mL 的 GNRs，在 1000 rpm 的

FT-IR光谱,复合物,特征吸收峰,硕士学位论文

天津医科大学硕士学位论文动峰，1545 cm-1的位置处出现较弱的吸收峰是 N-H 弯曲酰胺Ⅱ带的特征吸收峰，证明了 PHIS 成功通过酰胺反应mSiO2-NH2表面。由 TPGS 的 FT-IR 光谱 2@PHIS@TPGS 复合物在 2961 cm-1和 2928 cm-1的位置处 TPGS 的特征吸收峰，为 TPGS 上的对称亚甲基 CH2-的了 TPGS 成功组装在 GNRs@mSiO2@PHIS 表面。金纳米结果进步证实了金纳米棒复合物的成功制备。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R735.34;R943;TB383.1

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