Bortezomib联用Obatoclax在急性白血病细胞上的协同细胞毒性作用及其机制研究

发布时间：2020-05-17 04:01

【摘要】：研究背景:急性淋巴细胞白血病(AcuteLymphoblastic Leukemia,ALL)是一种淋巴祖母细胞恶性增殖的血液性疾病。ALL同时可见于儿童和成人,常见于2-5岁儿童。随着治疗仪器和手段的进步,目前儿科ALL治愈率高达90%,但成人治愈率仅为30%左右。对于难治性/复发性ALL,患者治愈率和5年生存率低,这仍然是国际治疗的难题。因此,新治疗策略的开发和肿瘤分子机制的研究显得尤为重要。硼替佐米(bortezomib)是一种合成的高选择性26S硼酸盐蛋白酶体抑制剂,2003年被美国FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤,并于2006年底批准治疗套细胞淋巴瘤。Bortezomib是目前研究最为广泛的一种蛋白酶体抑制剂,体外实验表明它对60种肿瘤细胞都有明显的抑制作用。且对多种血液疾病都有良好疗效,在ALL治疗上处于临床Ⅱ/Ⅲ期。B淋巴细胞瘤-2基因(B cell lymphoma-2,Bcl-2)是最早研究与细胞凋亡相关的一类原癌基因。Bcl-2家族蛋白分为抗凋亡蛋白(Bcl-2,Bcl-xl,Bcl-w,Mcl-1和A1等)和促凋亡蛋白(Bak,Bax,Bok,Bik,Bim等)。Bcl-2家族蛋白主要定位于线粒体,并且通过线粒体途径调控细胞凋亡。由于大部分肿瘤细胞过表达Bcl-2等蛋白,研究员开发了一系列的Bcl-2家族蛋白抑制剂,其中包括obatoclax,AT-101,ABT-199 等等。研究目的:自噬和泛素-蛋白酶体是细胞内蛋白降解的两大通路,前者主要负责降解长寿蛋白和损伤的细胞器,后者则负责短寿蛋白的降解。bortezomib是一种有效的26S硼酸盐蛋白酶体抑制剂,但同时可以诱导自噬引起药物耐受。单独使用bortezomib后,发现会造成一些抗凋亡蛋白的蓄积,如Mcl-1。因此,本课题中我们设计并探索了 bortezomib 联用 Bcl-2 抑制剂(obatoclax、AT-101、ABT-199)是否在急性淋巴白血病细胞上出现协同细胞毒性作用的实验方案。并对bortezomib联用obatoclax的协同细胞毒性机制进行初步的阐释和研究,希望能为临床研究中解决单药活性低、易耐药提供一个有价值的参考,也为临床上药物联合应用提供一个新的治疗方案。研究方法:1.MTT检测药物的细胞毒性作用2.Western blot检测bortezomib单独处理细胞后抗凋亡蛋白的变化情况3.MTT联合应用CompuSyn软件计算药物联用指数及联用前后浓度变化4.流式细胞术和Western Blot分别检测bortezomib联用obatoclax对白血病细胞凋亡的影响5.RT-PCR检测bortezomib联用obatoclax引起白血病细胞内质网应激反应相关基因的影响6.ER stress抑制剂TUDC对药物联用组细胞活性和凋亡的影响1)MTT检测TUDC对药物联用组细胞活性的影响。2)流式细胞仪检测TUDC对药物联用组细胞凋亡的影响。研究结论:1.Bortezomib、Obatoclax、AT-101和ABT-199单独使用可以显著性抑制白血病细胞Jurkat和Nalm-6细胞活力。2.Bortezomib单独处理细胞后造成抗凋亡蛋白Mcl-1显著蓄积。3.Bortezomib联用Obatoclax可以协同诱导白血病细胞的凋亡,但Bortezomib分别联用ABT-199、AT-101在MTT上并未发现协同作用。4.Bortezomib联用Obatoclax可以同时阻断自噬和泛素-蛋白酶体两大蛋白降解通路。5.Bortezomib联用Obatoclax引起内质网应激反应CHOP介导的细胞凋亡产生协同作用。6.内质网应激抑制剂(TUDC)可减少由内质网应激介导药物联用组(bortezomib + obatoclax)细胞的凋亡。
【图文】：

根据各药物的ＩＣ５。确定两药联用的摩尔比，我们选择药物作用浓度为１／４逡逑ＩＣ５０、１／２ＩＣ５０、ＩＣ５０、２ＩＣ５０、４ＩＣ５０，通过邋ＭＴＴ邋比色方法，测量邋０Ｄ邋值，并应逡逑用ＣｏｍｐｕＳｙｎ软件，计算药物联用指数ＣＩ及联用前后浓度的变化。从图１－３、逡逑１－４与表１－２、１－３中可看到，两药联用指数ＣＩ均小于ｌ，ｊｕｒｋａｔ的ＣＩ邋（０．５２？０．８４）、逡逑Ｎａｌｍ－６的ＣＩ邋（０．４８？０．７４），，说明两药联用在ｊｕｒｋａｔ和ｎａｌｍ６细胞中都具有协同逡逑细胞毒性作用。从图１－５看到，在Ｊｕｒｋａｔ上，ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ分别联用ＡＢＴ－１９９、逡逑ＡＴ－１０１邋的邋ＣＩ邋为（０．８－１．６邋），（邋１．０－２．３邋）；在邋Ｎａｉｍ邋６邋上，ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ邋分别联用邋ＡＢＴ－１９９、逡逑ＡＴ－１０１的ＣＩ为（０．８－２．１），（０．７－１．４），两组细胞的平均ＣＩ值都接近或大于１，逡逑说明两药协同效果不佳或有拮抗作用。逡逑Ｊｕｒｋａｔ逡逑１２0＿逦0ｂａ逡逑＾邋ｉ00＾—邋逦邋ｂｏｒ逡逑＾逦逦逦逦逦邋－ａ－邋0ｂａ＋ｂｏｒ逡逑０邋Ｈ逦１逦１逦１逦１逦１逡逑ｏｂａｔｏｃｌａｘ逦（ｊｘＭ）逦０逦０．２５逦０．５逦１．０逦２．０逦４．０逡逑ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ逦（ｎＭ）逦０逦１．２５逦２．５逦５．０逦１０逦２０逡逑ＣＩ逦０．５２逦０．５３逦０．５３逦０．５５逦０．８４逡逑图１－３：邋Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ及ｏｂａｔｏｃｌａｘ对人白血病细胞ｊｕｒｋａｔ的活力曲线及联用指数（ＣＩ）邋（４８邋ｈ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－３邋：邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｖｉａｂｉｌｉｔｙ邋ａ

根据各药物的ＩＣ５。确定两药联用的摩尔比，我们选择药物作用浓度为１／４逡逑ＩＣ５０、１／２ＩＣ５０、ＩＣ５０、２ＩＣ５０、４ＩＣ５０，通过邋ＭＴＴ邋比色方法，测量邋０Ｄ邋值，并应逡逑用ＣｏｍｐｕＳｙｎ软件，计算药物联用指数ＣＩ及联用前后浓度的变化。从图１－３、逡逑１－４与表１－２、１－３中可看到，两药联用指数ＣＩ均小于ｌ，ｊｕｒｋａｔ的ＣＩ邋（０．５２？０．８４）、逡逑Ｎａｌｍ－６的ＣＩ邋（０．４８？０．７４），说明两药联用在ｊｕｒｋａｔ和ｎａｌｍ６细胞中都具有协同逡逑细胞毒性作用。从图１－５看到，在Ｊｕｒｋａｔ上，ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ分别联用ＡＢＴ－１９９、逡逑ＡＴ－１０１邋的邋ＣＩ邋为（０．８－１．６邋），（邋１．０－２．３邋）；在邋Ｎａｉｍ邋６邋上，ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ邋分别联用邋ＡＢＴ－１９９、逡逑ＡＴ－１０１的ＣＩ为（０．８－２．１），（０．７－１．４），两组细胞的平均ＣＩ值都接近或大于１，逡逑说明两药协同效果不佳或有拮抗作用。逡逑Ｊｕｒｋａｔ逡逑１２0＿逦0ｂａ逡逑＾邋ｉ00＾—邋逦邋ｂｏｒ逡逑＾逦逦逦逦逦邋－ａ－邋0ｂａ＋ｂｏｒ逡逑０邋Ｈ逦１逦１逦１逦１逦１逡逑ｏｂａｔｏｃｌａｘ逦（ｊｘＭ）逦０逦０．２５逦０．５逦１．０逦２．０逦４．０逡逑ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ逦（ｎＭ）逦０逦１．２５逦２．５逦５．０逦１０逦２０逡逑ＣＩ逦０．５２逦０．５３逦０．５３逦０．５５逦０．８４逡逑图１－３：邋Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ及ｏｂａｔｏｃｌａｘ对人白血病细胞ｊｕｒｋａｔ的活力曲线及联用指数（ＣＩ）邋（４８邋ｈ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－３邋：邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｖｉａｂｉｌｉｔｙ邋ａ
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96

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本文编号：2667897