工程纳米二氧化钛对端粒的遗传毒性影响与机制研究

发布时间：2020-05-17 12:14

【摘要】：工程纳米二氧化钛(Titanium dioxide nanoparticles,TiO_2-NPs)广泛用于环境、通信、材料和医学等领域,也作为添加剂分布在食物、牙膏、防晒霜等日用商品中。TiO_2-NPs主要经消化道或呼吸道进入人体并蓄积在肝和肺。已有研究表明,环境中各种来源的TiO_2-NPs暴露具有潜在遗传和细胞毒性效应,但其在细胞和亚细胞水平的毒性机制尚未得到完整的诠释。TiO_2-NPs遗传毒性及作用机制的解析,对工程纳米颗粒在环境、材料及日常生活中的安全应用、防范其对人类潜在的负面健康效应具有重要意义。TiO_2-NPs通过诱导产生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)而对细胞造成氧化胁迫。位于染色体末端、维持染色体结构和功能稳定的端粒是胞内ROS攻击的重要靶标之一,氧化胁迫可能诱使端粒长度(Telomere length,TL)异常,继而导致染色体不稳定(Chromosome instability,CIN)及细胞死亡路径改变。迄今为止,TiO_2-NPs对端粒的影响及分子机制尚未见系统报道。本研究根据TiO_2-NPs暴露后体内吸收分布与代谢的主要途径和靶器官特性,从细胞、染色体和分子等多层面,深入探讨了TiO_2-NPs对人上皮来源的皮肤、肝脏和肺细胞的氧化胁迫效应,以及对端粒与染色体稳定性的胁迫效应,综合剖析了TiO_2-NPs的遗传毒性与分子机制。(1)TiO_2-NPs对不同类型细胞的氧化胁迫效应:以人端粒酶阳性的肝细胞L-02、肝癌细胞QGY、肺细胞HBE及端粒酶阴性的皮肤细胞BJ为受试对象,分析TiO_2-NPs暴露后细胞ROS重要组分H_2O_2水平改变。结果显示,TiO_2-NPs以时间(0~72h)和剂量(0~80μg/mL)依赖的方式进入细胞,并引起胞内H_2O_2水平显著升高(P0.05);TiO_2-NPs暴露显著诱导BJ、L-02细胞氧化还原平衡调控关键基因Nrf-2的mRNA表达下调(P0.01),QGY细胞Nrf-2表达上调(P0.01),HBE细胞未出现Nrf-2表达改变;实验进一步在80μg/mL的TiO_2-NPs中,加入20μg/mL的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC),进行共暴露研究。结果发现,NAC仅在BJ细胞中降低了TiO_2-NPs诱发的ROS水平(P0.01)。研究提示,TiO_2-NPs暴露引起细胞氧化胁迫,而不同类型细胞的抗氧化能力存在差异,Nrf-2表达上调可能为增强细胞抗TiO_2-NPs胁迫效应起到积极作用。(2)TiO_2-NPs对端粒及其维护机制的影响:将上述细胞暴露于40和80μg/mL的TiO_2-NPs 72h,以RT-qPCR法评价TiO_2-NPs对细胞TL的影响,结果发现,TiO_2-NPs导致L-02、HBE和BJ细胞的TL显著缩短(P0.05),QGY细胞TL未发生相应改变。进一步分析端粒维护相关的端粒酶活性组分h ETRT、端粒结合蛋白复合物shelterin的mRNA水平,发现TiO_2-NPs显著诱导HBE细胞hTERT表达下调(P0.05)、shelterin表达不变;BJ细胞shelterin表达上调(P0.05);L-02细胞hTERT、shelterin表达均显著下调(P0.05);QGY细胞hTERT、shelterin表达均显著上调(P0.05)。将hETRT、shelterin与Nrf-2表达对比分析,发现端粒酶阳性细胞中,Nrf-2与shelterin的表达趋势一致,而端粒酶阴性的BJ细胞不存在类似对应关系,提示端粒酶阳性细胞的Nrf-2可能正向影响shelterin的转录。Nrf-2高表达可增强细胞抗氧化能力,hTERT和shelterin表达上调可提高细胞的端粒维护作用,相反,当Nrf-2表达下调,hTERT表达下调/不表达,shelterin表达也下调时,细胞抗氧化和端粒维护能力均被减弱,这可能是TiO_2-NPs暴露下,QGY细胞TL保持稳定,而L-02、HBE和BJ细胞TL缩短的重要途径。在20μg/mL NAC与80μg/mL TiO_2-NPs共暴露实验中,NAC显著抑制了TiO_2-NPs诱导的HBE、L-02和BJ细胞TL缩短(P0.01),提示细胞抗氧化能力的维护有利于TiO_2-NPs暴露下TL的结构稳定。(3)TiO_2-NPs对细胞和遗传稳定的影响:以胞质分裂阻断微核细胞组试验(cytokinesis-block micronucleus cytome assay,CBMN-Cyt),评价TiO_2-NPs暴露对CIN、细胞死亡(凋亡和坏死)的影响。结果显示,40和80μg/mL TiO_2-NPs暴露显著诱导L-02、HBE和BJ细胞的CIN升高(P0.05),但不影响QGY细胞的CIN;TiO_2-NPs在四株受试细胞中均诱导坏死率显著升高(P0.01)、与坏死相关的TNF-α、RIP3基因转录水平亦显著升高(P0.05)。20μg/mL NAC与80μg/mL TiO_2-NPs共暴露实验中,NAC显著降低受试细胞中TiO_2-NPs诱发的CIN(P0.05)及细胞死亡(P0.05)。研究提示,TiO_2-NPs暴露诱导正常细胞的CIN升高与TL缩短显著相关,癌细胞与正常生理水平细胞的抗胁迫能力存在差异,高剂量TiO_2-NPs可能经TNF-α-RIP3通路诱导细胞坏死,抗氧化剂NAC可对TiO_2-NPs相关遗传毒性起到一定防范和减缓作用。(4)基于环境暴露浓度下的细胞和遗传毒性分析:根据日常生活中人群TiO_2-NPs暴露剂量低且时间长的特点,研究模拟人群TiO_2-NOs暴露相近浓度(1~4μg/mL),选择TiO_2-NPs体内代谢、积累靶器官来源的L-02、HBE和QGY细胞处理12天,分析了细胞TL、CIN、细胞死亡的改变情况。结果显示,L-02细胞中,1μg/mL的TiO_2-NPs暴露引起CIN、细胞死亡升高(P0.05),TL无显著改变,4μg/mL的TiO_2-NPs暴露导致TL缩短、CIN和细胞死亡升高(P0.05);HBE细胞中,1μg/mL的TiO_2-NPs暴露引起TL延长(P0.05),CIN、细胞死亡无显著改变,4μg/mL的TiO_2-NPs暴露诱导TL缩短、CIN和细胞死亡升高(P0.05);QGY细胞中,1和4μg/mL的TiO_2-NPs均诱导TL缩短和细胞死亡升高(P0.05),CIN无显著改变。结果提示,不同类型细胞的TL、CIN和细胞死亡对低剂量TiO_2-NPs的敏感性存在差异,为了合理预警人群日常TiO_2-NPs暴露毒性限值及安全阈值,TiO_2-NPs的毒性评价应当考量不同组织及器官来源的细胞。综上,TiO_2-NPs暴露引起胞内ROS显著升高,诱导细胞氧化胁迫;此时Nrf-2、hTERT和shelterin的表达上调是细胞提高抗氧化能力、维持TL和染色体稳定的重要因素;如果TiO_2-NPs暴露诱导Nrf-2表达下调、hTERT不表达/表达下调、shelterin表达下调,则会损伤细胞抗氧化、端粒维护机制,导致细胞端粒缩短和CIN率升高。高剂量TiO_2-NPs暴露还通过提高TNF-α-RIP3通路活性,诱导细胞坏死率上升。TiO_2-NPs暴露诱导的上述遗传、氧化还原平衡负面效应在一定程度上加速了细胞衰老,是TiO_2-NPs影响人类健康、增加遗传-环境暴露相关疾病风险的重要机制。适度的抗氧化干预可有效防范TiO_2-NPs暴露的遗传毒性。
【图文】：

家族,环氧合酶,白细胞介素,细胞周期进程

27图 1.2 TiO2-NPs 的主要毒性作用机制Figure 1.2 The main toxic mechanisms of TiO2-NPs总之，TiO2-NPs 通过引起胞内大量 ROS 产生，诱导氧化应激，破坏 DNA、蛋白质的结构，引起胞内主要细胞器的结构功能紊乱，展现其毒性作用（图 1.2）。TiO2-NPs 还可以通过以上主要作用机制，激活胞内的细胞凋亡相关基因如 p53、NF-κB 通路、caspase 家族、Bax/Bcl-2，氧化损伤关键基因 Nrf-2、HO-1、SOD2，炎症应答相关基因如白细胞介素 IL 家族、TNF-α，改变胞内氧化还原相关酶如SOD、SIR3、环氧合酶、GSH 的表达，产生氧化胁迫，影响如 DNA 修复等重要细胞功能，破坏遗传物质、蛋白质、脂质的结构和功能稳定，扰乱细胞周期进程，影响基因组稳定性，，诱导细胞死亡及组织炎症，诱发疾病甚至癌症[1,204,219-221]。

示意图,端粒结合蛋白,端粒DNA,端粒酶

和一个富含 G 的 3’ 末端悬突（3’overhang）即单链 DNA 区组成（图1.3a）。端粒结合蛋白，也叫 shelterin 复合物，特异结合到端粒序列并使之形成端粒环，及 T 环（Telomere-loop，T-loop），以及位于 T 环内的配对环（displacementloop，D-loop），帮助端粒成帽（telomere capping）。Shelterin 帮助端粒 DNA 形成的 D-loop-t-loop 套索样结构可有效掩饰染色体末端类似 DNA 双链断裂（DNAdouble-strand break）的结构，避免其被 DNA 损伤机制识别
【学位授予单位】：云南师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R994.6

【参考文献】