γ-多聚谷氨酸对糖脂嫁接物胶束介导基因转染的影响

发布时间：2017-03-25 08:05

  本文关键词：γ-多聚谷氨酸对糖脂嫁接物胶束介导基因转染的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：壳聚糖-硬脂酸胶束(Chitosan-g-stearic acid, CS)具有较强的肿瘤细胞摄取能力和细胞核转运能力,其表面正电荷可有效密接质粒DNA (Plasmid DNA, pDNA),实现体内外基因有效转染和抗肿瘤疗效。前期研究结果表明,CS嫁接物胶束包封治疗基因进入靶细胞后,递送系统的内涵体快速逃逸和治疗基因的有效释放,是制约其基因转染效率的主因。为实现递送系统在靶细胞内的内涵体快速逃逸以及基因药物的有效释放,本研究构建壳聚糖-硬脂酸嫁接物/聚乙二醇化多聚谷氨酸/pDNA三元基因递送系统,考察聚乙二醇化多聚谷氨酸(Poly(ethylene glycol)-b-poly(γ-glutamic acid), PG)的引入对转染效率的影响、研究其相应的细胞摄取、内涵体逃逸和pDNA释放等过程的相关机理。本研究以18.0 kDa的壳聚糖(Chitosan)为原料,以碳二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, EDC)为交联耦合剂,通过CS侧链上的氨基和硬脂酸(Stearic acid, SA)上的羧基酰胺反应,合成CS。通过席夫反应在CS上键合聚乙二醇(Poly(ethylene glycol), PEG),合成聚乙二醇化的糖脂嫁接物(PEGylated chitosan-g-stearic acid, PCS)。核磁共振氢谱确证CS和PCS嫁接物的化学结构；三硝基苯磺酸法测定氨基取代度；芘荧光法测定临界胶束浓度；动态光散射法测定嫁接物胶束的粒径和表面电位；透射电镜观察胶束的大小和形态学特征。引入阴离子多肽PG,分别构建CS/pDNA, PCS/pDNA二元和CS/PG/pDNA三元基因递送系统。测定基因递送系统的粒径和表面电位,通过透射电镜观察其粒子大小和形态；凝胶电泳分析嫁接物胶束对pDNA的密接能力,以及DNase Ⅰ酶保护能力。以编码增强型绿色荧光蛋白pEGFP-C1为报告基因,以人胚肾细胞HEK293作为模型细胞,用荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,用FC定量测定其转染效率,比较二元、三元基因递送系统转染效率的差异；以食管癌细胞EC-1作为模型细胞,通过三种不同的复合方式分别制备CS/PG/pDNA-Ⅰ、 CS/PG/pDNA-Ⅱ和CS/PG/pDNA-Ⅲ三元基因递送系统,用激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope, CLSM)观察绿色荧光蛋白的表达,用FC定量测定其转染效率,比较和总结不同三元基因递送系统转染效率的差异和特点。MTT法考察递送系统及其对应载体的细胞毒性。用四甲基异硫氰酸罗丹明B (Rhodamine B isothiocyanate, RITC)标记的CS和PCS制备二元、三元基因递送系统,CLSM观察其细胞摄取、胞内内涵体逃逸和报告基因的细胞内释放过程。FC定量测定阳性细胞百分率和平均荧光强度,考察基因递送系统在HEK293和EC-1细胞上的摄取能力,以γ-多聚谷氨酸(Poly(y-glutamic acid), γ-PGA)为摄取抑制剂,研究基因递送系统在HEK293细胞上的入胞途径。以HEK293为模型细胞,CLSM共定位分析,研究基因递送系统的内涵体逃逸和报告基因的释放动力学；以巨噬细胞RAW264.7作为模型细胞,CLSM观察基因递送系统的细胞摄取,考察PEG修饰对基因递送系统被网状内皮系统(Reticuloendothelial system, RES)吞噬的影响。经EDC介导,得到两亲性CS嫁接物。核磁共振氢谱确证了CS和PCS的化学结构,二者的氨基取代度分别为7.1%和11.0%,其相应的临界胶束浓度分别为72.0和89.0 pg/mL;浓度为10mg/mL时,其表面电位分别为18.7±0.6和16.3±1.6 mV。TEM图显示胶束呈类球形,粒径较小,分布均一。嫁接物胶束具有较强的pDNA密接能力,当N/P比≥1时,CS完全阻滞pDNA迁移,CS/pDNA和PCS/pDNA二元、CS/PG/pDNA三元基因递送系统均具备DNaseI酶保护能力。体外基因转染结果显示,在HEK293细胞上,当N/C/P比为2.5：1：1时,CS/PG/pDNA三元基因递送系统达到最大基因转染效率40.8%,为CS/pDNA和PCS/pDNA-二元基因递送系统的30.4和50.0倍；在EC-1细胞上,当N/C/P比为10：1：1时,CS/PG/pDNA-Ⅲ三元基因递送系统达到最大基因转染效率11.6%,为CS/pDNA和PCS/pDNA二元基因递送系统的1.9和3.7倍。以γ-PGA为抑制剂,摄取实验结果表明,CS/PG/pDNA三元基因递送系统经由γ-PGA特异性受体介导的方式入胞；γ-P GA分子结构中的羧基质子化,促进了三元基因递送系统的内涵体逃逸；其的阴离子特性,通过松弛三元基因递送系统的密接结构、调节电荷密度,从而促进pDNA从基因递送系统中的释放。PEG修饰,减少了RAW264.7细胞对CS/PG/pDNA三元基因递送系统的摄取,表明PEG化可以降低RES对基因递送系统的吞噬作用。
【关键词】：壳聚糖-硬脂酸嫁接物 γ-多聚谷氨酸 聚乙二醇化 内涵体逃逸 pDNA释放 基因转染
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 缩写清单11-16
• 引言16-18
• 1 糖脂嫁接物的合成及其理化性质研究18-30
• 1.1 试剂与仪器18-19
• 1.1.1 试剂18
• 1.1.2 仪器18-19
• 1.2 实验方法19-21
• 1.2.1 壳聚糖-硬脂酸糖脂嫁接物的合成19
• 1.2.2 聚乙二醇化糖脂嫁接物的合成19
• 1.2.3 核磁共振分析19-20
• 1.2.4 氨基取代度测定20
• 1.2.5 临界胶束浓度测定20-21
• 1.2.6 粒径和表面电位测定21
• 1.2.7 透射电子显微镜观察21
• 1.3 结果与讨论21-27
• 1.3.1 糖脂嫁接物的合成及结构确证21-24
• 1.3.2 氨基取代度24-25
• 1.3.3 临界胶束浓度25-26
• 1.3.4 粒径与表面电位26-27
• 1.3.5 透射电子显微镜观察27
• 1.4 小结27-30
• 2 糖脂嫁接物/聚乙二醇化多聚谷氨酸/pDNA三元基因递送系统的基因转染研究30-50
• 2.1 试剂与仪器30-31
• 2.1.1 试剂30-31
• 2.1.2 仪器31
• 2.2 实验方法31-36
• 2.2.1 基因递送系统的制备31-33
• 2.2.2 粒径和表面电位测定33
• 2.2.3 透射电子显微镜观察33
• 2.2.4 凝胶阻滞分析33
• 2.2.5 酶保护实验33-34
• 2.2.6 细胞培养34
• 2.2.7 基因转染34-35
• 2.2.7.1 HEK293细胞系转染的荧光观察34
• 2.2.7.2 HEK293细胞系转染的定量研究34
• 2.2.7.3 EC-1细胞系转染的荧光观察34-35
• 2.2.7.4 EC-1细胞系转染的定量研究35
• 2.2.8 细胞毒性35-36
• 2.2.8.1 基因载体与基因递送系统的细胞毒性35
• 2.2.8.2 基因递送系统的转染毒性35-36
• 2.3 结果与讨论36-49
• 2.3.1 粒径和表面电位36-37
• 2.3.2 凝胶阻滞分析37-38
• 2.3.3 酶保护实验38-39
• 2.3.4 透射电子显微镜观察39-40
• 2.3.5 基因转染40-47
• 2.3.5.1 HEK293细胞系转染的荧光观察及定量42-43
• 2.3.5.2 EC-1细胞系转染的荧光观察及定量研究43-47
• 2.3.6 胞毒性47-49
• 2.2.6.1 基因载体与基因递送系统的细胞毒性47-49
• 2.3.6.2 基因递送系统的转染毒性49
• 2.4 小结49-50
• 3 糖脂嫁接物/聚乙二醇化多聚谷氨酸/pDNA三元基因递送系统的基因转染机制研究50-68
• 3.1 试剂与仪器50-51
• 3.1.1 试剂50-51
• 3.1.2 仪器51
• 3.2 实验方法51-54
• 3.2.1 细胞培养51
• 3.2.2 基因递送系统细胞摄取51-53
• 3.2.2.1 基因载体荧光标记51-52
• 3.2.2.2 基因递送系统摄取的荧光观察52
• 3.2.2.3 基因递送系统定量摄取52
• 3.2.2.4 抑制性摄取实验52-53
• 3.2.3 基因递送系统的内-溶酶体逃逸机制53
• 3.2.4 基因递送系统的pDNA释放动力学53-54
• 3.2.4.1 凝胶阻滞实验53
• 3.2.4.2 pDNA体外释放53-54
• 3.3 结果与讨论54-66
• 3.3.1 基因递送系统细胞摄取54-57
• 3.3.1.1 基因递送系统摄取的荧光观察54-56
• 3.3.1.2 定量摄取研究56-57
• 3.3.2 内吞抑制剂对基因递送系统摄取的影响57-58
• 3.3.3 基因递送系统的巨噬细胞RAW264.7摄取58-61
• 3.3.4 基因递送系统的内-溶酶体逃逸机制61-62
• 3.3.5 pDNA释放机制62-66
• 3.3.5.1 凝胶阻滞分析62-64
• 3.3.5.2 共聚焦显微镜观察64-66
• 3.4 结论66-68
• 4 结论68-70
• 参考文献70-76
• 综述76-96
• 参考文献90-96
• 作者简历96

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