固定化酶制备降血糖肽及其生物学活性评价

发布时间：2020-05-22 17:53

【摘要】：随着生活水平提高,糖尿病的发病率也越来越高,严重威胁人类的生命健康。而生物活性肽作为一种新型降血糖药物,副作用较小,在防治糖尿病方面具有较高的应用价值。传统酶解法制备生物活性肽对自由蛋白酶的需求量较大,且酶活不稳定。目前糙米已成为糖尿病患者的最佳食材,其营养成分丰富,有助于胰脏分泌胰岛素,降低血糖。因此本研究以糙米作为原料,使用固定化酶制备降血糖肽,检测其降血糖活性。以聚偏氟乙烯微孔滤膜(F膜)作为载体,采用共价结合法固定胰蛋白酶,通过响应面试验获得固定化工艺参数,采用扫描电镜和红外光谱对固定化酶进行表征。建立固定化酶制备糙米降血糖肽的水解度动力学模型。构建糙米降血糖肽的分离纯化方法,先后使用超滤、离子交换、凝胶过滤层析与反相高效液相方法,再采用液质联用方法分析降血糖肽氨基酸序列,然后进行分子对接,建立抑制动力学模型,从分子层面研究降血糖肽作用机制与类型。通过体内检测降血糖肽对高血糖小鼠的降血糖作用、生长状况以及肠道菌群平衡的影响,研究肠道菌群与糖尿病之间的关系。试验结果如下:胰蛋白酶固定化最优工艺为:戊二醛浓度2.11wt%,酶浓度6.43mg/mL,温度23.57℃。在最优条件下预测酶活回收率达到63.1947%,经过验证酶活回收率为62.25%。固定化胰蛋白酶的最适温度为55℃,最适pH值为8.5,热稳定性、pH值稳定性均高于自由酶;同时固定化酶在重复使用6次以后,仍然保留初始酶活的67.82%;与自由酶相比,固定化胰蛋白酶的储存稳定性提高了18.00%。根据扫描电镜图可以看出固定化酶载体表面出现大量球状突出点,同时在傅里叶红外光谱图上胰蛋白酶内肽键伸缩振动的酰胺带在1100~1000cm~(-1)出现特征峰。以水解度作为评价指标,通过单因素试验分析自由酶与固定化酶水解能力,固定化酶最优水解条件为:加酶量520 cm~2/g,底物浓度6 mg/mL,温度55℃,pH 8.5,反应时间50min,水解度可以达到24.72%,相比自由酶水解度提高了63.38%。在固定化酶酶解体系最优条件下,固定化酶重复使用5次后,水解度保留初始水解度的72.34%。建立固定化酶可控酶解动力学模型为DH=4.5767ln[1+(5.2121 E_0/S_0-0.5032)t]。以α-葡萄糖苷酶抑制率作为评价指标,分别检测不同多肽组分的降血糖活性,其中P-II-B-b-2组分活性最大,IC50为0.097mg/mL。根据二级质谱推断降血糖肽的氨基酸组成序列,分子量为362.99的多肽可能是Gly-Met-Arg,分子量为476.11的多肽包括Asn-Trp-Arg、Gly-Asp-Lys-Arg和Asp-Gly-Lys-Arg,分子量为589.12的多肽包括Lys-Arg-Glu-Arg、Pro-Trp-Met-Arg、Val-Trp-Glu-Arg和Cys-Arg-Gly-Pro-Arg。通过分子对接,多肽可以与α-葡萄糖苷酶中心部位紧密结合,抑制α-葡萄糖苷酶的活性。其中Gly-Asp-Lys-Arg的IC50最小,为0.039mg/mL,抑制效果最好。最后通过研究Gly-Asp-Lys-Arg对α-葡萄糖苷酶抑制动力学发现,K_m值基本保持不变,而V_m逐渐减少,属于非竞争性抑制作用类型,抑制常数K_m=5.405×10~(-3)mol/L。多肽治疗35天后,四氧嘧啶高血糖小鼠的血糖值明显降低,小鼠糖尿病症状,如小鼠毛色、活动能力、反应能力与食欲等各种情况均有明显改善,并提高存活率。通过对小鼠肠道优势菌分离鉴定,肠道菌群包括链球菌、肠杆菌、微球菌、假单胞杆菌与弧菌等。高血糖小鼠肠道内有害菌数量增加,益生菌数量减少。经糙米多肽治疗后,高血糖小鼠血糖降低,肠道微生态平衡得到明显改善恢复。
【学位授予单位】：江苏科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q814.2;R965

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