背根神经节TRPM8膜转运和P2Y1R调控NMDA受体磷酸化在瑞芬太尼痛觉过敏中的作用研究

发布时间：2020-05-23 21:38

【摘要】：目的研究背根神经节TRPM8膜转运和P2Y1R调控NMDA受体磷酸化在瑞芬太尼痛觉过敏发生机制中的作用。内容利用瑞芬太尼痛觉过敏大鼠模型,研究背根神经节TRPM8膜转运、NMDA受体磷酸化和P2Y1R表达的改变,并明确TRPM8膜转运和P2Y1R在瑞芬太尼痛觉过敏发生机制中的具体作用及NMDA受体磷酸化对其的介导作用。方法第一部分:瑞芬痛敏(R)组尾静脉输注瑞芬太尼1 μg·kg-1·min-160min;对照(C)组输注生理盐水(NS)60 min。于尾静脉输注前24 h,输注后2、6、24和48 h(T0-4),每组取8只大鼠测定右后爪机械缩足反应阈(MWT)、热缩足潜伏期(TWL)和冷板抬足次数(NPL)后处死,取右侧L4-6背根神经节(DRG),采用 RT-qPCR 测 TRPM8、NMDA 受体亚型 NR1 和 NR2B 及 P2Y1R mRNA,western blot 测总蛋白 TRPM8、膜蛋白 TRPM8、pNR1、NR1、pNR2B、NR2B和P2Y1R水平,并计算膜蛋白和总蛋白TRPM8表达的比值(m/tTRPM8)。第二部分实验一:对照(C)组和TRPM8拮抗剂(RQ)组腹腔注射NS或RQ-00203078,尾静脉输注NS60min;瑞芬痛敏(R)和瑞芬痛敏+TRPM8拮抗剂(R+RQ)组腹腔注射NS或RQ-00203078,尾静脉输注瑞芬太尼1 μg·kg-1·min-160min。尾静脉输注前10min行腹腔注射。T0-4时测定右后爪MWT、TWL和NPL后处死大鼠,取右侧 L4-6 DRG,采用 RT-qPCR 测 NR1 和 NR2B mRNA,western blot测pNR1、NR1、pNR2B和NR2B,免疫荧光测pNR1和pNR2B阳性神经元百分率。第二部分实验二:对照(NS+NS)组鞘内和腹腔皆注射NS;TRPM8拮抗剂(NS+RQ)组鞘内和腹腔注射NS和RQ-00203078;NMDA受体激动剂(NMDA+NS)组鞘内和腹腔注射NMDA和NS;NMDA受体激动剂+TRPM8拮抗剂(NMDA+RQ)组鞘内和腹腔注射NMDA和RQ-00203078。四组大鼠尾静脉皆输注瑞芬太尼1 μg·kg-1 · min-1 60 min。尾静脉输注前1 h和10 min分别行鞘内和腹腔注射,T0-4时测NPL。第三部分实验一:对照(C)组和P2Y1R拮抗剂(MRS)组鞘内注射NS或MRS2179,尾静脉输注NS 60 min;瑞芬痛敏(R)组和瑞芬痛敏+P2Y1R拮抗剂(R+MRS)组鞘内注射NS或MRS2179,尾静脉输注瑞芬太尼1μg·kg-1 · min-160 min。尾静脉输注前10 min行鞘内注射。T0-4时测右后爪MWT、TWL和NPL后处死大鼠,取右侧L4-6 DRG,采用RT-qPCR测 NR1 和 NR2B mRNA,western blot 测 pNR1、NR1、pNR2B 和 NR2B,免疫荧光测pNR1和pNR2B阳性神经元百分率。第三部分实验二:对照(NS+NS)组鞘内皆注射NS;P2Y1R拮抗剂(NS+MRS)组鞘内注射NS和MRS2179;NMDA受体激动剂(NMDA+NS)组鞘内注射NMDA和NS;NMDA受体激动剂+P2Y1R拮抗剂(NMDA+MRS)组鞘内注射NMDA和MRS2179;四组大鼠尾静脉皆输注瑞芬太尼1 μg·kg-1 · min-1 60 min。尾静脉输注前1 h和10 min鞘内分别注射 NMDA 和 MRS2179,T0-4 时测 MWT、TWL 和 NPL。结果第一部分:与C组比较,R组T1-4MWT降低、TWL缩短、NPL增加,TRPM8、NR1、NR2B 和 P2Y1R mRNA 增加,总蛋白和膜蛋白 TRPM8、m/t TRPM8、pNR1、NR1、pNR2B、NR2B和P2Y1R蛋白增加。R组随时间延长MWT逐渐降低,TWL逐渐缩短,NPL逐渐增多;TRPM8、NR1、NR2B和P2Y1RmRNA逐渐提升,总蛋白和膜蛋白 TRPM8、m/tTRPM8、pNR1、NR1、pNR2B、NR2B和P2Y1R蛋白逐渐增加。第二部分实验一:与C组比较,R组T1-4MWT降低,TWL缩短,NPL增多;与R组比较,R+RQ组T1-4 NPL减少,MWT和TWL的差异无统计学意义。与C组比较,R组NR1和NR2B mRNA增加,pNR1、NR1、pNR2B和NR2B蛋白增加,pNR1和pNR2B阳性神经元百分率增加;与R 组比较,R+RQ 组 NR1 和 NR2B mRNA 下降,pNR1、NR1、pNR2B 和 NR2B蛋白下降,pNR1和pNR2B阳性神经元百分率降低。第二部分实验二:与NS+NS组比较,NS+RQ组T1-4NPL 减少,NMDA+NS 和 NMDA+RQ组T1-4 NPL 增加;与NMDA+NS组比较,NMDA+RQ组T1-4 NPL的差异无统计学意义。第三部分实验一:与C组比较,R组T1-4 MWT降低,TWL缩短,NPL增多;与R组比较,R+MRS组T1-4 MWT升高,TWL延长,NPL减少。与C组比较,R组NR1和 NR2B mRNA增加,pNR1、NR1、pNR2B 和 NR2B 蛋白增加,pNR1 和 pNR2B阳性神经元百分率增加;与R组比较,R+MRS组NR1和NR2B mRNA降低,pNR1、NR1、pNR2B和NR2B蛋白降低,pNR1和pNR2B阳性神经元百分率减少。第三部分实验二:与NS+NS组比较,NS+MRS组T1-4MWT增加、TWL延长、NPL 减少,NMDA+NS 和 NMDA+MRS 组T1-4MWT 降低、TWL 缩短、NPL 增加;与 NMDA+NS 组比较,NMDA+MRS组T1-4MWT、TWL 和 NPL 的差异无统计学意义。结论TRPM8膜转运的减少通过抑制NR1和NR2B的磷酸化削弱瑞芬太尼诱发的冷痛觉过敏。P2Y1R拮抗剂通过抑制NR1和NR2B的磷酸化削弱瑞芬太尼诱发的机械触诱发痛、热和冷痛觉过敏。
【图文】：

冷板,大鼠,次数,背根神经节

图１两组大鼠不同时点ＭＷＴ、ＴＷＬ和冷板抬足次数的比较逡逑与Ｃ组比较，＊Ｐ＜０．０１；与Ｔ。时比较，＃Ｐ＜０．０１逡逑神经节ＴＲＰＭ８邋ｍＲＮＡ水平的改变逡逑组比较，尺组！＾时背根神经节ＴＲＰＭ８邋ｍＲＮＡ水平增加（Ｐ＜较，Ｒ邋}D邋ＩＶ４邋时邋ＴＲＰＭ８邋ｍＲＮＡ邋水平Ｊ；调（Ｐ＜０．０１）；邋Ｒ邋组邋Ｔｍ邋时邋平随时间延长逐渐增加（Ｐ＜０．０１）。Ｃ组各时点ＴＲＰＭ８邋ｍＲＮＡ计学意义（Ｐ＞0．0５）。见表８，图２。逡逑１７逡逑

与邋Ｔ0邋时比较，Ｒ邋}D邋ＩＶ４邋时邋ＴＲＰＭ８邋ｍＲＮＡ邋水平Ｊ；调（Ｐ＜０．０１）；邋Ｒ邋组邋Ｔｍ邋时邋ＴＲＰＭ８逡逑ｍＲＮＡ水平随时间延长逐渐增加（Ｐ＜０．０１）。Ｃ组各时点ＴＲＰＭ８邋ｍＲＮＡ水平的逡逑差异无统计学意义（Ｐ＞0．0５）。见表８，，图２。逡逑１７逡逑
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96

【参考文献】