pH敏感型聚合物胶束缓解抗癌药物肝毒性的研究

发布时间：2020-05-25 13:28

【摘要】：纳米技术可以提高癌症化学治疗的疗效。纳米药物应用于癌症治疗具有多种优势,例如可提高疏水药物的溶解性、增加载药量、延长循环系统时间、改进肿瘤靶向性、促进细胞摄取、促进药物的溶酶体逃逸以及药物的应答释放等。尽管如此,只有较少部分(1%)药物通过生物分布过程最终在肿瘤组织中积累,其余大多数的纳米药物进入了其他健康的器官,尤其是肝脏。肝脏是新陈代谢的主要部位,也是单核巨噬细胞系统的重要组成部分。由于肝巨噬细胞对纳米药物的作用,肝脏中通常有大量的药物积累,这可能会对肝脏产生严重的毒副作用。当被纳米载体包载的药物具有严重肝毒性时使得这种作用更加明显。很多化疗药物具有严重的肝毒性。甲氨蝶呤(MTX),作为一种有效的细胞毒性药物广泛应用于急性白血病,恶性淋巴瘤等癌症的治疗。甲氨蝶呤与叶酸结构相似,可以和二氢叶酸还原酶结合,阻断叶酸转变为四氢叶酸,因而抑制细胞内一碳转移,使得DNA及RNA的合成受阻。甲氨蝶呤已被证实具有较强的肝毒性,能诱发肝纤维化甚至肝硬化,这使得其临床应用受到限制。尽管甲氨蝶呤造成肝毒性的机理尚不十分明确,但众多研究表明其造成的氧化应激现象是产生肝毒性的重要原因。肝保护分子被认为是缓解纳米药物产生肝毒性的有效手段。齐墩果酸(OA)是一种天然存在的五环三萜类化合物,研究表明其对由各种化学物质引起的急性肝损伤以及慢性肝纤维化具有保护作用。目前,OA已作为治疗肝脏疾病的非处方药在中国上市。OA产生肝保护的机理较为复杂,其中激活核转录因子(Nrf2)缓解氧化应激的机理被普遍认为是产生肝保护作用的主要原因。此外,齐墩果酸还具有抗肿瘤,抗骨质疏松,抗炎,降脂等众多药理作用。然而,其较差的水溶性(Log P=7.5)限制了其临床应用和治疗效果。传统的物理载药方式载药量通常较低(5%),并不能很好的改善这一问题。两亲性前药胶束纳米载体可有效提高载药量并控制不同药物递送比例。响应型纳米粒子的设计可进一步加速药物在细胞中的释放,从而更好的提高药效。细胞中内涵体/溶酶体的酸性微环境为药物的按需释放提供了可能。本课题设计了一种pH敏感型OA前药胶束载体包载MTX作为概念模型来缓解化疗产生的肝毒性。腙键作为pH敏感基团对OA和聚乙二醇(PEG)进行连接,从而得到两亲性聚合物。腙键的引入使得OA前药胶束具有pH响应特性,可使胶束在靶向部位快速裂解释放药物,从而实现抗癌、保肝的双重作用。首先,利用果糖酸(LA)修饰OA得到LA-OA,然后和单端为酰肼的mPEG进行反应得到具有腙键的两亲性聚合物mPEG-OA。核磁共振谱图,红外谱图及紫外谱图结果均证明目标聚合物的成功合成。OA的载药量为17.6%(w/w)。OA,LA-OA及mPEG-OA的紫外吸收光谱及荧光发射光谱无明显差异。利用OA的自身荧光测定得到mPEG-OA的临界胶束浓度(CMC)为27.3±0.4μg/mL(10.5±0.2μM),较低的CMC数值说明制备的聚合物胶束具有良好的稀释稳定性。MTX通过透析的方法物理包载于mPEG-OA中,透析介质为pH=8.0的氨水以维持腙键的稳定性。经高效液相色谱测定MTX的载药量为5.1±0.3%(w/w)。MTX较多包载于疏水性空腔内可能是由于MTX和OA之间的氢键作用,由于其化学结构,两者均可作为氢的供体和受体。经DLS测定,空白胶束(OA-NCs)和载药胶束(OA-NCs/MTX)的水力学半径分别为69±6 nm和101±10 nm。TEM结果证实两种胶束均为粒径均一的圆球状,粒径分别为35±5 nm和67±8 nm。包载MTX后胶束粒径增加。体外药物释放实验分别在中性(pH=7.4)及酸性(pH=5.0)条件下测定。LA-OA及MTX释放结果均表现出良好的pH依赖性,即酸性条件下药物释放量明显高于中性条件,从而证实胶束具有pH响应特性。此外,利用MTT法分别对载药胶束和空白胶束进行细胞毒性实验。OA,LA-OA及OA-NCs的细胞毒性结果表明,三种样品的OA浓度均为60μM且孵育48 h时4T1细胞存活率依旧高于70%,说明三种样品的细胞毒性相对较小。MTX和OA-NCs/MTX样品同样孵育4T1细胞48 h进行测定,计算可得两样品的IC_(50)分别为29.4±3.5μM和22.0±2.6μM。OA-NCs/MTX的细胞毒性高于游离药物,可能由于其中包含的OA产生的毒性。mPEG-OA的细胞摄取实验在4T1细胞中开展,利用共聚焦显微镜进行分析。由于OA的荧光发射峰位于400 nm以内,利用摩尔比为1:1的mPEG-FITC和mPEG-OA通过透析的方式制备了FITC标记的混合胶束。mPEG-FITC中mPEG的分子量为1,000 Da以确保其自组装能力。水力学粒径的测定间接证实了混合胶束的成功制备。共聚焦图片显示随着时间的延长,细胞中FITC的荧光逐渐增强,从而说明混合胶束的不断摄取。已知MTX是一种特定的细胞周期抑制剂,是由于其抑制二氢叶酸还原酶从而阻断叶酸转变成四氢叶酸,影响嘌呤新合成和脱氧尿嘧啶核苷酸转变为脱氧胸腺嘧啶核苷酸,使DNA及RNA的合成受阻。细胞周期实验中,MTX实验组S期较正常细胞明显升高,可知MTX将细胞周期阻滞在S期,与文献报道一致。细胞经OA前药胶束处理后G_2/M期升高,可知OA对于4T1细胞也具有一定的细胞周期阻滞作用。载药胶束OA-NCs/MTX同时含有OA和MTX两种药物,细胞周期结果显示S期较正常细胞明显升高,而G_2/M期较游离MTX实验组升高但仍较低于正常细胞。为了探究共轭胶束的生物分布,利用透析的方法制备了Cy5和MTX共包载的胶束。利用荧光测定Cy5的包载量为1.2%(w/w)。将制得的荧光胶束通过尾静脉注射于具有4T1肿瘤模型的BALB/c小鼠体内作为实验组,注射游离Cy5的小鼠作为对照组。由活体成像结果可知,实验组的荧光强度在注射后6-8小时达到峰值,符合实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect,即EPR效应)。相反,对照组的荧光强度从注射后3小时到24小时均明显低于实验组(p0.05),说明胶束递送可有效延长药物在体内的血液循环时间并且能将药物更多的递送到肿瘤部位。体外器官成像结果可知,Cy5在主要的器官中也有一定积累,例如:肝、肾、肺等,这可能与Cy5的代谢路径有关。随后进行了体内抗癌及肝保护相关实验。在BALB/c小鼠腋下部位接种4T1细胞以建立肿瘤模型。实验分为五组:1.对照组(正常小鼠);2.PBS;3.游离药物MTX;4.OA前药胶束(OA-NCs);5.载药胶束(OA-NCs/MTX),每组6只小鼠。所有样本中,MTX和OA的给药量相同。治疗周期内每隔48 h量取肿瘤体积,由此可得肿瘤抑制能力如下:OA-NCs/MTXfree MTXOA-NCsPBS。MTX和OA均具有抗肿瘤作用,且胶束更易聚集在肿瘤部位,因此载药胶束表现出最好的肿瘤抑制效果,和预想结果一致。由于MTX比OA作为抗肿瘤药物的作用更强,所以MTX比OA前药胶束具有更好的抗肿瘤效果。并且治疗周期内四个实验组的小鼠体重并未出现显著变。疗效研究的最后,所有小鼠通过眼球取血后取出肿瘤组织及主要器官。从四个实验组小鼠收集到的肿瘤质量经测定与肿瘤抑制曲线一致。同样,五组小鼠的肝脏也全部收集,肝脏相对整个小鼠体重的质量百分比,被用来间接说明肝毒性。游离MTX组的相对肝重较正常组显著增加,而OA-NCs/MTX组在相同MTX剂量下的相对肝重虽高于正常组但相比MTX组明显降低(p0.01)。这可能是由于OA发挥肝保护作用从而降低了MTX产生的肝毒性。肿瘤组织制作成石蜡切片,通过HE染色实验进行组织学分析,证实了OA-NCs/MTX良好的抗癌效果。同样,为探究不同样品导致的癌症细胞凋亡情况进行了TUNEL染色实验,结果表明OA-NCs/MTX处理的肿瘤组织中凋亡细胞最多,与HE实验所得结果一致,从而说明其具有良好的抗肿瘤效果。为了探究OA对于MTX造成的肝损伤的缓解作用,对肝毒性相关指标进行测定。取出的各组小鼠血液静置离心后得到血清,对血清中天冬氨酸转氨酶(AST)及丙氨酸转氨酶(ALT)活性进行测定。共递送OA和MTX的pH敏感型胶束(OA-NCs/MTX)组的ALT和AST活性与MTX组相比明显减少(p0.01)而与OA前药胶束组相比无显著性差别(p0.05),说明OA可有效降低MTX造成的肝损伤。乳酸脱氢酶(LDH)在组织损伤和细胞损伤中可被释放,利用试剂盒对其活性进行测定。由结果可知,OA的存在可以显著降低由MTX引起的血清中LDH的升高。取出的各组小鼠肝脏分为两部分,一部分利用预冷的生理盐水制成10%(w/v)肝组织匀浆,另一部分固定在4%的多聚甲醛中待组织学检测。利用试剂盒对肝脏匀浆中ALT、AST和LDH的活性进行测定,结果与血清中相应指标趋势一致,说明将MTX包载于共轭胶束OA-NCs中可减少肝组织中这三种指标活性。众多文献表明MTX引起的肝损伤涉及氧化应激(OS)现象。氧化应激一般包含活性氧(ROS)的过度产生和对正常氧化还原反应的干扰,这很容易导致组织损伤。丙二醛(MDA)作为一个典型的OS指标,通过试剂盒对其在肝匀浆中的含量进行测定。由于MTX的作用,MDA含量与正常组相比显著增加,而经OA-NCs/MTX治疗的小鼠MDA含量较MTX组明显下降趋近于正常组(p0.01)。此结果说明OA可有效降低MDA的产生。同样作为氧化应激指标的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)可减少不同类型的ROS,保护机体免受氧化损伤。MTX治疗后使得GSH-Px和SOD的酶活降低,但是OA-NCs/MTX扭转了这一趋势,说明OA可有效缓解OS从而起到肝保护作用。肝组织的HE染色显示,游离药物MTX治疗后的肝脏组织表现出在中央静脉周围的坏死病灶、炎症细胞浸润、空泡变性等,说明MTX产生的严重肝毒性。此外,PBS组也呈现一定程度的肝损伤,可能是由于癌症本身产生的器官损伤。相反,经过OA-NCs/MTX和OA-NCs治疗的小鼠比MTX和PBS组显示的肝脏病变明显减少,而OA-NCs组较OA-NCs/MTX组表现出较少的炎症细胞浸润并且最接近正常肝脏,进一步证明OA前药胶束可有效治疗肝损伤。此外,还通过TUNEL染色实验对肝脏部分进行了分析。所有的样本中均未出现明显的绿色荧光,意味着在肝脏部分没有明显的细胞凋亡。但MTX组的细胞核与正常组相比呈异常分布,而经过OA治疗后的小鼠肝脏结果趋近于正常组织,与HE结果一致。综上所述,本课题设计的新型OA前药胶束具有良好的pH响应特性,可有效缓解MTX导致的肝毒性。本课题采用的肝保护方法适用于多种抗肿瘤药物和保肝材料,可为减少化疗产生的肝毒性提供了一种新的思路。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943

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