hTLR8激动剂分子识别与作用机理研究

发布时间：2020-05-25 22:22

【摘要】：Toll样受体(Toll Like Receptors,TLRs)是人类免疫系统的重要模式识别受体家族,可识别相关病原体特有分子模式并激活先天性免疫反应。作为单链RNA(Single Stranded RNA,ssRNA)受体,hTLR8(Human Toll Like Receptor 8)与肿瘤、微生物感染以及炎性疾病密切相关。因此,hTLR8激动剂分子识别与作用机理研究对免疫调控类药物研发具有重要理论意义和应用价值。为探寻影响hTLR8激动剂活性的关键结构/性质特征,论文首先采用显露化学模式(Emerging Chemical Pattern,ECP)、系统聚类分析法(Hierarchical Cluster Analysis,HCA)以及分子对接(Molecular docking)方法,对已有hTLR8激动剂进行了分子识别研究。在此基础上,通过分子动力学(Molecular Dynamics,MD)和靶向动力学(Targeted Molecular Dynamics,TMD)模拟方法,对激动剂诱导的hTLR8构象变化与信号传导过程进行了探索性研究,研究结果可为hTLR8激动剂药物研发及作用机理提供重要的理论参考依据。主要研究结果如下:(1)采用ECP模式识别方法,对97个hTLR8激动剂和114个非激动剂样本建立了分子识别模型,研究结果显示:仅采用6个描述子的最优ECP模型对132个训练集样本、79个验证集样本和75个外部测试集样本的预测准确性分别为83.3%、81.0%和80.0%;当将最优ECP模型与Surflex分子对接模型联用时,组合模型(ECP-Surflex)对外部测试集的预测准确性、灵敏度和特异性分别为94.2%、97.2%和87.5%。研究结果显示:与非激动剂相比,激动剂具有明显的氢键和亲疏水性不对称分布特征。(2)采用ECP方法,对97个hTLR8激动剂和29个拮抗剂建立了识别模型。研究结果显示:采用3个描述子的最优模型对76个训练集样本和50个验证集样本的预测准确性分别为93.4%和92.2%。研究结果显示:激动剂与hTLR8具有更强氢键相互作用特征,而拮抗剂与hTLR8则以疏水相互作用为主。(3)经序列比对和缺失残基补齐,对空载状态下hTLR8受体进行三维模建和动力学优化,所得最优模型在结构和能量上均合理可靠。基于该最优模型,采用Surflex-dock分子对接和动力学方法构建了激动剂CL097、CL075和R848与hTLR8复合物的过渡态模型。研究结果显示:CL075和R848与hTLR8形成了相对稳定的复合物过渡态模型。(4)以CL097、CL075、R848激动剂与hTLR8复合物的过渡态模型为起始构象,激动剂与hTLR8天然结合构象为目标构象,采用靶向分子动力学模拟方法对激动剂诱导的hTLR8构象变化与二聚化过程进行了探索性研究。通过对TMD模拟过程中残基RMSF变化以及相邻LRR间氢键相互作用分析,推测由激动剂诱导的构象变化经LRR外层残基,尤其是带电氨基酸残基介导的氢键相互作用由近至远向末端传导,最终引发了hTLR8单体的二聚化过程。
【图文】：

重庆大学硕士学位论文进行多序列比对分析(NCBI-BLAST)，结果显示：TLR 受体家族胞外区较差，仅有 37 处相同残基和 79 处相似残基，一致性和相似性序列分 9.1%；TLR7、TLR8 和 TLR9 胞外区序列具有更高的同源性，一致性列分别为 7.1%和 15.2%。 1.1 为 TLR1 到 TLR10 胞外区序列进化树分析结果。TLRs 按序列同源两大类，一类是跨细胞膜受体蛋白(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR)，另一类则是跨溶酶体膜受体蛋白(TLR3、TLR7、TLR8、TLR9)；跨蛋白根据所识别的底物类型又可分为三类，分别是以脂蛋白为底TLR2、TLR6；以细菌鞭毛蛋白为底物的 TLR5 和以细菌壁脂多糖为4；跨溶酶体膜受体蛋根据识别的底物可分为两类，分别是以病毒单、识别底物的 TLR7/8 和以病毒 DNA 为识别底物的 TLR9。

图 1.2 Toll 样受体的底物识别及其介导的免疫应答[39]Figure 1.2 PAMPs of TLRs and the TLR-mediated immune response1.3 hTLR8 的结构与功能人源 TLR8(hTLR8)为细胞内溶酶体跨膜蛋白，同样由胞外区，跨膜区，胞内区组成。具有底物识别功能的 hTLR8 胞外区是由两条单体组成的同源二聚体结构，每条单体具有 800 多个氨基酸残基。每条 hTLR8 单体具有 26 个富含亮氨酸的重复序列区域22。hTLR8 胞外区具有两类特异性底物结合位点，，可识别 ssRNA 的降解产物，即去磷酸化尿嘧啶核糖核苷(Nonphosphorylated Uridine Nucleoside, NUN)和短链寡聚核糖核苷酸(Short Oligonucleotides)[40, 41]。图1.3为hTLR8胞外区的三维结构示意图。图1.3a为空载状态构象(Apo State)，可以看出每个单体分别含有 6 个短的 Loop 区域(LRR2，LRR5，LRR8，LRR11，LRR18，LRR20)以及一个长 Z-Loop 区域(位于 LRR14、15 之间，约由 40 个氨基酸残基构成)。图 1.3b 为配体结合构象(Holo State)，可以看到位于二聚体结合界面中的尿苷结合位点以及与位于马蹄结构凹面上的短链寡聚核糖核苷酸 UG 结合的
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96

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本文编号：2680830