B降胆甾苯并咪唑化合物的抗肿瘤机制研究
发布时间：2020-05-25 23:50
【摘要】：甾体化合物广泛存在于自然界中,在甾体母体中引入杂原子,杂环或取代一个或多个原子通常会导致其生物学特性的改变。本课题组前期研究发现,B降胆甾苯并咪唑化合物具有良好的体外抑制肿瘤细胞增殖活性,为进一步研究其抗肿瘤活性机制,本文设计了以下三个部分内容:一、选取体外抑制增殖活性较好的四个B降胆甾苯并咪唑化合物,采用MTT法与细胞划痕实验初步测定四个化合物对肿瘤细胞的体外增殖活性与细胞迁移能力的影响,并利用Annexin V-FITC/PI法,细胞周期法和线粒体膜电位等流式细胞术研究化合物诱导细胞凋亡机制;二、采用蛋白免疫印迹western blot法研究了细胞凋亡相关蛋白表达;三、UHPLC-QE-MS非靶标细胞代谢组学分析方法探究其靶点,探讨B降胆甾苯并咪唑化合物的抗肿瘤机制,为该类化合物的药物研发提供理论基础。具体内容如下:1、检测了B降胆甾苯并咪唑化合物对人卵巢癌细胞(SKOV 3)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺导管癌细胞(T47D)和人乳腺癌细胞(MCF-7)等4种人性腺肿瘤细胞的作用。实验结果表明,B降胆甾苯并咪唑化合物能够有效的抑制4种人性腺肿瘤细胞的增殖,其中对SKOV 3细胞有良好抑制迁移作用;此外B降胆甾苯并咪唑化合物还可以诱导SKOV 3细胞凋亡,阻滞其生长S期,引发线粒体膜电位崩溃。2、运用免疫印迹蛋白法(western blot)检测相关凋亡因子PARP、caspase-9、caspase-3、Bax及Bcl-2的表达水平。实验结果表明,B降胆甾苯并咪唑化合物激活线粒体途径信号通路诱导SKOV 3细胞凋亡。3、采用正、负离子模式相结合的UHPLC-QE-MS非靶标代谢组学分析方法,对连接不同取代基团的B降胆甾苯并咪唑化合物1、2进行药物作用后的SKOV 3细胞代谢产物分别与阴性对照组的细胞内代谢物差异及其代谢通路变化进行对比探究。结果表明:(1)化合物1干扰主要涉及9条代谢通路:精氨酸和脯氨酸代谢(Arginine and proline metabolism)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(Alanine,aspartate and glutamate metabolism)、组氨酸代谢(Histidine metabolism)、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢(D-Glutamine and D-glutamate metabolism)、半胱氨酸和蛋氨酸代谢(Cysteine and methionine metabolism)、氨酰基-tRNA生物合成(Aminoacyl-tRNA biosynthesis)、嘌呤代谢(Purine metabolism)、谷胱甘肽代谢(Glutathione metabolism)、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢(D-Arginine and D-ornithine metabolism)以及氮代谢(Nitrogen metabolism)。从代谢组学角度分析了化合物1通过干扰SKOV 3细胞氨基酸代谢、蛋白质合成,减缓能量代谢,从而抑制其肿瘤细胞的增殖和信号转导、抑制侵袭和转移、诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。(2)化合物2作用SKOV 3细胞后,发生改变的代谢通路主要涉及甘油磷脂代谢(Glycerophospholipid metabolism)、精氨酸和脯氨酸代谢、嘌呤代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(Glycine,serine and threonine metabolism)、醚脂代谢(Ether lipid metabolism)5条代谢通路。其中影响最大、富集程度最深的代谢通路是甘油磷脂代谢。甘油酸酯在细胞膜功能与结构中发挥主要的作用,由此可知,化合物2主要是通过干扰SKOV 3细胞的细胞膜结构或功能抑制其增殖。此外,还涉及精氨酸和脯氨酸代谢,所以化合物2同样也可以抑制SKOV 3细胞侵袭和转移,诱导细胞凋亡。
【图文】：
.3.2 B 降胆甾苯并咪唑化合物对 SKOV 3 细胞迁移的影响划痕愈合实验主要用于检测肿瘤细胞的迁移能力，将 SKOV 3 细胞接种到 6板中，待细胞融合率达到 70%-80% 时，然后用 200 μL 吸头制造划痕，使用有添加胎牛血清（FBS）的非完全培养基进行 B 降胆甾苯并咪唑化合物浓度梯稀释配置，使其细胞失去增殖能力，化合物处理后通过分别测定 0 h、24 h 划宽度的变化来研究细胞的迁移能力。结果如图所示，随着处理时间的延长，BControl 15 μmol·L-1μmol·L-10 h24 h130 μmol·L-1μmol·L-1
降胆甾苯并咪唑化合物处理组的划痕愈合速度显著慢于 DMSO 对照组的划痕愈合速度，说明 B 降胆甾苯并咪唑化合物能抑制 SKOV 3 细胞的迁移能力。2.3.3 B 降胆甾苯并咪唑化合物对 SKOV 3 细胞凋亡的影响本实验采用 Annexin V/PI 法，按照凋亡试剂盒说明书进行操作，检测化合物 1-4 以 0 ~ 40 μmol·L-1分别处理 24 h、48 h 是否诱导 SKOV 3 细胞凋亡。结果表明，化合物 1-4 均能明显诱导 SKOV 3 细胞产生凋亡。由图 2-3 可得，在化合物处理前 SKOV 3 细胞生长状态良好，随着化合物的添加，细胞形态逐渐发生改变。当化合物浓度达到 30μmol·L-1时，细胞收缩变圆，出现凋亡小体，，且随着化合物浓度的增大，细胞收缩程度越明显。流式细胞仪检测结果显示：当化合物作用 SKOV 3 细胞 24 h 后，化合物 1-4 均可明显诱导 SKOV 3 细胞晚期凋亡。10 μmol·L-1、20 μmol·L-1的化合物作用 SKOV 3细胞 24 h后，没有产生显著的诱导凋亡作用，但当浓度增大为30 μmol·L-1与 40μmol·L-1，产生显著凋亡现象。当浓度为 30 μmol·L-1时，化合物 1-4 晚期凋亡细胞比例分别为 15.24%、9.33%、20.03% 和 10.40%；当浓度为 40 μmol·L-1时，
【学位授予单位】：南宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96
【图文】：
.3.2 B 降胆甾苯并咪唑化合物对 SKOV 3 细胞迁移的影响划痕愈合实验主要用于检测肿瘤细胞的迁移能力，将 SKOV 3 细胞接种到 6板中，待细胞融合率达到 70%-80% 时，然后用 200 μL 吸头制造划痕，使用有添加胎牛血清（FBS）的非完全培养基进行 B 降胆甾苯并咪唑化合物浓度梯稀释配置，使其细胞失去增殖能力，化合物处理后通过分别测定 0 h、24 h 划宽度的变化来研究细胞的迁移能力。结果如图所示，随着处理时间的延长，BControl 15 μmol·L-1μmol·L-10 h24 h130 μmol·L-1μmol·L-1
降胆甾苯并咪唑化合物处理组的划痕愈合速度显著慢于 DMSO 对照组的划痕愈合速度，说明 B 降胆甾苯并咪唑化合物能抑制 SKOV 3 细胞的迁移能力。2.3.3 B 降胆甾苯并咪唑化合物对 SKOV 3 细胞凋亡的影响本实验采用 Annexin V/PI 法，按照凋亡试剂盒说明书进行操作，检测化合物 1-4 以 0 ~ 40 μmol·L-1分别处理 24 h、48 h 是否诱导 SKOV 3 细胞凋亡。结果表明，化合物 1-4 均能明显诱导 SKOV 3 细胞产生凋亡。由图 2-3 可得，在化合物处理前 SKOV 3 细胞生长状态良好，随着化合物的添加，细胞形态逐渐发生改变。当化合物浓度达到 30μmol·L-1时，细胞收缩变圆，出现凋亡小体，，且随着化合物浓度的增大，细胞收缩程度越明显。流式细胞仪检测结果显示：当化合物作用 SKOV 3 细胞 24 h 后，化合物 1-4 均可明显诱导 SKOV 3 细胞晚期凋亡。10 μmol·L-1、20 μmol·L-1的化合物作用 SKOV 3细胞 24 h后，没有产生显著的诱导凋亡作用，但当浓度增大为30 μmol·L-1与 40μmol·L-1，产生显著凋亡现象。当浓度为 30 μmol·L-1时，化合物 1-4 晚期凋亡细胞比例分别为 15.24%、9.33%、20.03% 和 10.40%；当浓度为 40 μmol·L-1时，
【学位授予单位】：南宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96
【参考文献】
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1 岳磊;张W
本文编号：2680931
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