昆布多糖纳米硒的制备及其对人肝癌细胞的生长抑制作用研究

发布时间：2020-05-26 16:52

【摘要】：目的:昆布多糖作为一种安全性高并具有多种生理活性的天然β-1,3-葡萄糖聚合物,被广泛应用于生物医药领域。本文通过以昆布多糖修饰获得了一种粒径较小、均一稳定且具有良好抗肝癌活性的纳米硒,并采用分子生物学手段对其抗肝癌机制进行了深入研究。方法:利用昆布多糖作为稳定剂和修饰剂,以抗坏血酸还原亚硒酸钠的方法制备得到昆布多糖修饰的纳米硒(LP-SeNPs)。应用透射电子显微镜(TEM)、激光粒度仪、紫外可见光谱、能量散射X射线光谱仪等仪器对合成的纳米硒进行结构表征。采用MTT法研究LP-SeNPs对HepG2肝癌细胞的增殖抑制作用,应用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测LP-SeNPs对细胞凋亡的影响。Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Casepase 9及自噬相关蛋白LC3、p62的表达水平。通过溶酶体活性和酸性的评估检测LP-SeNPs对溶酶体功能的影响。结果:制备得到了粒径大小为60 nm的昆布多糖纳米硒,TEM测定结果发现,LP-SeNPs呈现单分散均匀的球形结构,MTT结果表明,LP-SeNPs对人肝癌HepG2细胞表现出明显的增殖抑制作用。进一步的作用机制研究发现,LP-SeNPs被肝癌细胞摄取后,首先定位于溶酶体,然后由溶酶体释放入胞质发挥作用。Western blot结果显示,LP-SeNPs作用HepG2细胞12和24 h均显著上调Bax和cleaved Casepase 9的表达,并下调Bcl-2的表达水平,表明LP-SeNPs可激活线粒体途径凋亡。此外,孵育LP-SeNPs后能诱导LC3-II和p62蛋白的上调,并能通过影响溶酶体的功能抑制自噬后期进程。结论:本文所制备的昆布多糖纳米硒对人肝癌细胞具有显著的生长抑制作用,其可能是通过抑制自噬和诱导细胞凋亡发挥对人肝癌细胞的抗肿瘤作用。本实验为抗肝癌药物的进一步研究提供了实验依据和理论基础。
【图文】：

通过调节昆布多糖的浓度可控制所得硒纳米粒子的粒径大小。如图2-1A 所示，当昆布多糖的浓度为 1 mg/mL（0.1%）时，所制备的硒纳米颗粒粒径最小，平均粒径为 60 nm。所制备的 LP-SeNPs 溶液的照片和 Zeta 电位显示在图 2-1B中。溶液的颜色表明形成的硒纳米颗粒是橙红色的。LP-SeNPs 的 Zeta 电位值大于SeNPs 的值，且所制备的 LP-SeNPs 溶液在室温下放置两个月后无明显聚集和沉淀，表明昆布多糖修饰后的 LP-SeNPs 与未修饰的 SeNPs 相比具有更好的稳定性。TEM照片如图 2-1C 所示，表明所制备的 LP-SeNPs 为均一球形单分散的颗粒，平均粒径为 58 nm，与激光粒度仪的粒径结果一致。元素分析的结果见图 2-1D 中。分析结果显示

1.5 和 2.5 h，用荧光酶标仪测定各孔的荧光强度。如图2-2A 所示，荧光强度显示时间和剂量依赖性，，提示细胞对 LP-SeNPs 的摄取以时间和剂量依赖的方式进行。纳米材料主要通过内吞作用进入细胞[22]。Lyso Tracker Red 是一种荧光染料，用于溶酶体的荧光成像，以检测 LP-SeNPs 在 HepG2 细胞中的位置。如图 2-2B 所示，绿色和红色荧光的重合清楚地表明 LP-SeNP 和溶酶体在 HepG2 细胞中的共定位。这些结果表明溶酶体是 LP-SeNPs 的主要靶器官，定位于溶酶体中的 LP-SeNPs 以时间依赖性方式增加。图 2-2 昆布多糖纳米硒的体外摄取与细胞内定位A.HepG2 细胞对香豆素-6 负载的 LP-SeNPs 的摄取分析；B.香豆素-6 负载的昆布多糖纳米硒的细胞内定位。标尺为 20 μm。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943;R96

【参考文献】

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本文编号：2682136