免疫毒素T-CUS的制备及其体外抗乳腺癌活性研究

发布时间：2017-03-26 05:13

  本文关键词：免疫毒素T-CUS的制备及其体外抗乳腺癌活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 免疫毒素(Immunotoxins,IT)又称为生物导弹,是由单克隆抗体连接一定量的细胞毒素(Cytotoxin,CTX)制成的一种免疫复合物,是一类能定向攻击靶细胞的药物。本实验研究制备曲妥珠单克隆抗体(Trastuzumab,T,商品名为赫赛汀)与南瓜蛋白(Cucurmosin,CUS)的偶联物即免疫毒素(T-CUS),旨在充分利用前者的靶向、选择性强和后者活性高的特点,消除前者疗效偏低和后者副作用偏大等缺陷;检测制备的免疫毒素对靶细胞的免疫活性和体外杀伤作用,寻求新的治疗HER-2阳性乳腺癌的方法。方法 1免疫毒素的制备:先后使用SPDP、2-IT作为交联剂,用化学交联法制备两种免疫毒素即T-CUS-PDP和T-CUS-2-IT。2免疫毒素的纯化:用Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析和Sp-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱进行纯化,并用SDS-PAGE进行电泳鉴定,用BCA法进行定量。3免疫毒素结合活性测定:用细胞ELISA法检测T-CUS-PDP、T-CUS-2-IT对靶细胞的结合活性。4用SRB法比较CUS、CUS-PDP、CUS-2-IT对乳腺癌细胞BT-474和HCC1937的体外杀伤作用。5用SRB法比较T、T-PDP的高浓度组和低浓度组分别对乳腺癌细胞BT-474和HCC1937的体外杀伤作用。6用SRB法比较CUS、T、T-CUS-PDP、T-CUS-2-IT及CUS与T联合对乳腺癌细胞BT-474和HCC1937的体外杀伤作用。结果 1用SPDP、2-IT作为交联剂通过化学交联法制备的免疫毒素经Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析和Sp-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱纯化后通过SDS-PAGE鉴定,在抗体上方有出现较明显的免疫毒素的条带,免疫毒素T-CUS-PDP、T-CUS-2-IT制备成功。2制备的两种免疫毒素与单纯曲妥珠单抗相比,与BT-474细胞的结合活性没有明显变化,能保持原有免疫活性。3 CUS用SPDP交联后,对BT-474细胞的IC50从0.325μg/ml升至1.736μg/ml,活性损失了80%左右;对HCC1937细胞的IC50从0.298μg/ml升至0.904μg/ml,活性损失了70%左右;实验换用2-IT作为交联剂后,对BT-474细胞的IC50从0.325μg/ml升至0.365μg/ml,对HCC1937细胞的IC50从0.298μg/ml升至0.316μg/ml,活性均保留了约90%。4曲妥珠单抗用SPDP交联后,仍保留了对BT-474细胞的大部分活性。T对BT-474细胞的IC50为0.124μg/ml,T-PDP对BT-474细胞的IC50为0.143μg/ml,T-PDP仍保留了抗体大部分的活性。另外不管是低浓度组还是高浓度组,T和T-PDP对HCC1937细胞都没有明显的杀伤作用,在实验所设浓度下达不到半数抑制作用。5免疫毒素T-CUS-PDP对BT-474细胞的IC50为0.011μg/ml,按质量浓度计算,比CUS高了约30倍,比T高了约10倍;T-CUS-2-IT对BT-474细胞的IC50为0.008μg/ml,比CUS高了约40倍,比T高了约16倍。CUS与T两者联合用药实验结果表明,免疫毒素对BT-474细胞的作用不是T与CUS两种药物单独作用的简单加和,曲妥珠单抗连接CUS可以显著提高对乳腺癌BT-474细胞的杀伤力。免疫毒素T-CUS-PDP和T-CUS-2-IT在实验所设的相同的浓度梯度范围内,对HCC1937细胞没有明显的杀伤作用。结论 1用SPDP、2-IT作为交联剂可成功构建由T和CUS结合而成的免疫毒素。2免疫毒素的纯化不是一个很简单的过程,免疫毒素彻底分离纯化的方法须在今后的研究中不断探寻。3 T-CUS-PDP,T-CUS-2-IT的免疫活性与偶联前比无明显差异,能够保持原有活性。4用SPDP交联的CUS比用2-IT交联的CUS活性下降明显,但用两者与T制备的免疫毒素对BT-474细胞的活性均有显著提高,且用2-IT交联得到T-CUS-2-IT活性提高更多。本研究为探寻新的治疗HER-2阳性乳腺癌的方法提供了参考。
【关键词】：乳腺癌 曲妥珠单抗 南瓜蛋白 免疫毒素 体外杀伤作用
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 英文缩略词表6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 前言11-14
• 第一部分 免疫毒素T-CUS的制备及鉴定14-29
• 1 材料14-16
• 1.1 药物与主要试剂14
• 1.2 主要仪器14-15
• 1.3 有关溶液的配置15-16
• 2 方法16-21
• 2.1 用SPDP作为交联剂制备免疫毒素T-CUS-PDP16-17
• 2.2 用 2-IT作为交联剂制备免疫毒素T-CUS2IT17
• 2.3 免疫毒素的纯化17-19
• 2.4 免疫毒素的鉴定19-21
• 3 结果21-26
• 4 讨论26-28
• 5 小结28-29
• 第二部分 细胞培养及T-CUS-PDP、T-CUS2IT免疫活性的测定29-37
• 1 材料29-30
• 1.1 药物及试剂29
• 1.2 细胞株29
• 1.3 仪器29
• 1.4 有关溶液的配置29-30
• 2 方法30-32
• 2.1 细胞培养30-31
• 2.2 细胞ELISA法检测免疫毒素的免疫活性31-32
• 3 结果32-35
• 4 讨论35-36
• 5 小结36-37
• 第三部分 免疫毒素体外抗乳腺癌活性研究37-52
• 1 材料37-38
• 1.1 药物及试剂37
• 1.2 细胞株37
• 1.3 仪器37
• 1.4 有关溶液的配置37-38
• 2 方法38-39
• 2.1 SRB法实验步骤38
• 2.2 CUS及CUS与两种交联剂交联后活性测定38-39
• 2.3 曲妥珠单抗及与SPDP交联后活性测定39
• 2.4 CUS、T、T-CUS-PDP和T-CUS2IT及CUS与T联合用药对靶细胞的杀伤作用39
• 2.5 统计学处理39
• 3 结果39-50
• 4 讨论50-52
• 5 结论52
• 参考文献52-56
• 文献综述56-62
• 参考文献60-62
• 致谢62

【参考文献】

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1 谢捷明,许建华,陈明晃,许盈,赵蓉,俞昌喜,吴国华;南瓜蛋白对B16细胞的诱导分化作用(简报)[J];福建医科大学学报;2004年04期

2 魏明卉,李英,刘征;核糖体失活蛋白及研究进展[J];南都学坛;2001年06期

3 王晗;于蕊;张晓鹏;任军;谢娜;樊红艳;张金龙;房婷;于长明;陈薇;;人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建及体外亲和筛选[J];军事医学;2013年02期

4 汲言山,贺永怀,陈兴,赵薇薇,沈倍奋;不同交联方法制备的免疫毒素及其体内外特性[J];生物化学与生物物理进展;1991年06期

5 熊长云,张祖传;一组丝瓜籽小分子核糖体失活蛋白LuffinS的分离、纯化和性质[J];生物化学与生物物理学报;1998年02期

6 申苏建;吴金明;金思思;黄智铭;吴建胜;;免疫毒素EGFR mab-RTA的制备及鉴定[J];中国生物制品学杂志;2010年05期

7 葛海良 ,张惠珍 ,周光炎 ,陆德源;抗CEA单抗-天花粉蛋白偶联物的研制及活性鉴定[J];上海免疫学杂志;1993年01期

8 沈倍奋;单克隆抗体与毒素的连接[J];细胞与分子免疫学杂志;1989年02期

9 王慧,张英起,颜真;碘乙酰胺在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的应用[J];药物生物技术;2003年06期

10 袁鹏;朱梁军;李晟;陈宝安;;三阴乳腺癌中Ki-67、P53、E-cadherin的表达及临床意义[J];中国现代医药杂志;2010年12期

  本文关键词：免疫毒素T-CUS的制备及其体外抗乳腺癌活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：268310