G蛋白偶联苦味受体舒张大鼠主动脉的作用及机制研究

发布时间：2020-05-28 03:11

【摘要】：背景:G蛋白偶联苦味受体(Bitter taste receptors,TAS2Rs)是G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)超家族的一员。TAS2Rs的早期研究主要集中在味觉系统。然而,近年来有关TAS2Rs在呼吸系统、生殖系统以及心血管系统的发现逐渐引起人们的关注。研究表明,TAS2Rs在血管平滑肌细胞中表达,且TAS2Rs激动剂,苯甲地那铵、氯喹和奎宁可以舒张苯肾上腺素预收缩的豚鼠主动脉。然而,目前有关TAS2Rs在大鼠主动脉表达水平的研究未有文献报道,且其调控大鼠主动脉血管的作用及机制尚不明确。目的:明确TAS2Rs在大鼠主动脉组织及分离的血管平滑肌细胞中的表达水平,利用三种TAS2Rs激动剂,苯甲地那铵、氯喹和奎宁,研究TAS2Rs对大鼠主动脉血管的调控作用,阐明其调控血管功能的机制。实验方法:1.利用荧光定量PCR技术检测TAS2Rs在大鼠主动脉组织和主动脉血管平滑肌细胞中的表达水平。2.利用离体组织浴槽实验,采用60 mM KCl、10μM苯肾上腺素和电刺激(10 V,25 Hz)三种条件预收缩大鼠主动脉血管环,研究两种TAS2Rs激动剂,苯甲地那铵和氯喹对三种条件预收缩的大鼠主动脉血管环的作用;研究奎宁对10μM苯肾上腺素和电刺激(10 V,25 Hz)两种条件预收缩的大鼠主动脉血管环的作用;进一步研究三种TAS2Rs激动剂调控血管的作用是否依赖于内皮细胞。3.利用离体组织浴槽实验,使用L型钙离子通道抑制剂nifedipine、非选择性钾离子通道抑制剂tetraethylammonium(TEA)、PLC抑制剂U-73221以及肌质网钙泵抑制剂thapsigargin,研究TAS2Rs调控大鼠主动脉的作用机制。结果:1.qPCR实验结果表明,在大鼠主动脉组织以及分离的血管平滑肌细胞中有6个TAS2Rs亚型表达。在主动脉血管组织中TAS2R143、TAS2R135、TAS2R126、TAS2R120、TAS2R121和TAS2R108相对于内参基因GAPDH的表达水平分别为0.30±0.16%、0.19±0.08%、0.16±0.08%、0.07±0.04%、0.04±0.05%和0.07±0.03%;在分离的血管平滑肌细胞中,TAS2R143、TAS2R135、TAS2R126、TAS2R120、TAS2R121和TAS2R108相对于内参基因GAPDH的表达水平分别为2.01±0.71%、1.22±0.90%、0.20±0.08%、0.19±0.08%、0.10±0.03%和0.03±0.02%。2.在60 mM KCl预收缩大鼠主动脉血管环的条件下,苯甲地那铵(50-1000μM)和氯喹(10-300μM)均可舒张预收缩的大鼠主动脉血管环,且该舒张作用具有浓度依赖性;其中,当苯甲地那铵和氯喹浓度分别为1000μM和300μM时,两者的舒张作用分别可达94.9±5.5%(P0.05)和87.2±3.9%(P0.05)。3.在苯肾上腺素预收缩大鼠主动脉血管环的条件下,20μM苯甲地那铵可使主动脉血管瞬时舒张(P0.05),随后收缩,收缩作用可达43.4±22.1%(P0.05),苯甲地那铵(800-1500μM)可舒张大鼠主动脉血管环,且该舒张作用具有浓度依赖性,1500μM苯甲地那铵的舒张作用可达96.0±4.9%(P0.05);氯喹(20-300μM)及奎宁(100-200μM)对苯肾上腺素预收缩的大鼠主动脉血管环也具有舒张作用,且该舒张作用具有浓度依赖性,当氯喹和奎宁浓度分别达到300μM和200μM时,两者对大鼠主动脉血管环的舒张作用为100.5±3.7%(P0.05)和98.1±2.6%(P0.05)。4.在电刺激(10 V,25 Hz)预收缩大鼠主动脉血管环的条件下,300μM和500μM苯甲地那铵对主动脉血管的舒张的作用分别为81.1±7.0%和89.1±5.5%(P0.05);氯喹(50-200μM)呈浓度依赖性地舒张预收缩的大鼠主动脉血管环(P0.05),且200μM氯喹舒张作用可达88.1±1.8%;200μM奎宁的舒张作用可达85.9±3.0%(P0.05)。5.当去除大鼠主动脉血管的内皮细胞后,氯喹(20-300μM)和奎宁(100-200μM)对苯肾上腺素预收缩大鼠主动脉血管环的舒张作用较内皮完整组无显著差异(P0.05),表明氯喹和奎宁对苯肾上腺素预收缩的大鼠主动脉血管环的舒张作用不依赖内皮细胞;苯甲地那铵(20-500μM)对苯肾上腺素预收缩的大鼠主动脉血管环舒张作用强于内皮完整组(P0.05)。6.TAS2Rs舒张预收缩的大鼠主动脉的机制研究实验结果表明,在苯肾上腺素预收缩的条件下,TEA可以减弱氯喹的舒张作用和苯甲地那铵的瞬时舒张作用:200μM氯喹的舒张作用从96.4±3.9%降低为71.9±10.7%(P0.05),20μM苯甲地那铵瞬时舒张作用消失(P0.05);Thapsigargin也可以减弱氯喹对苯肾上腺素预收缩主动脉血管环的舒张作用:300μM氯喹的舒张作用从100.5±3.7%降低为50.2±7.4%(P0.05);在Ca~(2+)通道抑制剂nifedipine存在的情况下,20μM苯甲地那铵引起血管收缩的反应消失(P0.05),奎宁的舒张作用减弱(P0.05)。结论:TAS2Rs在大鼠主动脉血管和分离的血管平滑肌细胞中有表达,TAS2Rs激动剂可能是通过激活大鼠主动脉血管中TAS2Rs而介导舒张血管的作用。三种TAS2Rs激动剂的作用机制有所不同:氯喹可能是通过激活TAS2Rs,从而激活钾离子通道和促进血管平滑肌细胞内钙离子重吸收回肌质网而发挥舒张作用;奎宁可能是通过激活TAS2Rs,抑制L型钙离子通道从而降低血管平滑肌细胞内Ca~(2+)浓度而引起血管舒张;苯甲地那铵可能是通过激活TAS2Rs,激活钾离子通道而发挥瞬时舒张作用,激活L型钙离子通道,从而增加细胞内钙离子浓度而引起血管收缩。
【图文】：

血管,表达水平,内参

图 3-1 TAS2Rs在大鼠主动脉血管和 VSMC中表达。大鼠主动脉血管和 VSM 相对于内参基因 GAPDH 的表达水平（Mean ±SEM; n = 6, N = 6; *P < 0.05 Aorta）。3-1 The mRNA expression level of TAS2Rs in rat aorta and VSMC. Relative eRs genes to the reference gene GAPDH in rat aorta and VSMC (Mean ±SEM; n =*P < 0.05, VSMC vs. Aorta).论于 TAS2Rs 在大鼠组织器官中表达水平的研究仅有几篇文献报道。乏特异性 TAS2Rs 的抗体，，研究多集中在其 mRNA 表达水平的在大鼠脑细胞中检测到了 TAS2R4、 TAS2R107 和 TAS2R38 mR近期，Foster 等在大鼠心脏中检测到 TAS2R108、TAS2R120、TA126、TAS2R135、TAS2R137 和 TAS2R143 等 7 种 TAS2Rs mRN于 TAS2Rs 在大鼠主动脉血管表达水平的研究未有文献报道。因此大鼠心脏中表达的 TAS2Rs 是否在大鼠主动脉血管中同样具有表达

预收缩,苯甲,氯喹,血管张力

4-1 苯甲地那铵舒张 60 mM KCl 预收缩的主动脉血管环。（A）苯甲地那铵降低Cl 预收缩的主动脉血管环张力的原始实验记录图。（B）苯甲地那铵对 60 mM KC主动脉血管环舒张作用的数据统计图（Mean ±SEM; n = 6, N = 6; *P < 0.05, Denatontrol）。igure 4-1 The relaxation effect of denatonium on aorta ring pre-contracted with 60 ) An original recording showing that denatonium decreased the tension of aorta ntracted with 60 mM KCl. (B) Summary data of the relaxation effect of denatonium on e-contracted with 60 mM KCl (Mean ±SEM; n = 6, N = 6; *P < 0.05, Denatonium vs. C② 氯喹对 60 mM KCl 预收缩的主动脉血管环的作用氯喹可浓度依赖性地舒张 60 mM KCl 预收缩的主动脉血管环（P ＜ 000 μM 氯喹可降低 87.2 ± 3.9% 的血管张力。氯喹（500 - 1000 μM）对预环张力降低的作用有所减弱。1000 μM 氯喹不能降低血管张力（P ＞图 4-2）。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965

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