新型吡唑啉衍生物BHX抗乳腺癌作用及机制研究

发布时间：2020-05-28 10:50

【摘要】：目的:BHX是一种新型吡唑啉衍生物,通过阻止Wnt/β-catenin信号通路而对多种肿瘤发挥出强效抗肿瘤作用。然而,其对乳腺癌增殖和转移的作用及相关机制尚不明确。本课题拟从以下两方面进行研究:1.体外体内研究BHX对乳腺癌的增殖抑制作用。2.深入研究BHX抑制乳腺癌增殖转移的可能作用机制。方法:1.检测BHX体内外对乳腺癌的增殖及转移的抑制作用;体外实验研究中,选取乳腺癌细胞系三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231作为研究对象,利用MTT法、二维克隆形成实验、Transwell侵袭实验、划痕实验进行研究;体内实验研究中,在裸鼠腋下通过皮下注射方式接种MDA-MB-231细胞,建立裸鼠皮下移植瘤模型,将裸鼠移植瘤小鼠随机分为四组,空白对照组、BHX低剂量给药组、BHX中剂量给药组、BHX高剂量给药组,腹腔注射给药,并且在裸鼠腋下通过皮下注射方式接种荧光素酶基因标记的MDA-MB-231细胞,建立裸鼠移植瘤模型,将裸鼠移植瘤小鼠随机分为空白对照组、BHX中剂量组,在给药前后分别进行小动物活体成像实验,通过研究裸鼠体内乳腺癌肿瘤体积抑制状况来探索BHX的体内药效。2.为了进一步研究BHX抑制人恶性乳腺癌增殖及转移的作用机制,我们研究了BHX对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞周期、细胞凋亡、细胞内ROS、WNT通路相关蛋白β-catenin以及与EMT相关的蛋白E-cadherin、SNAIL和Vimentin及其基因转录情况。首先我们利用流式细胞仪技术检测了BHX对MDA-MB-231细胞系细胞周期及细胞凋亡的影响,然后检测了BHX对细胞内ROS产生量的影响,最后通过Western blot技术检测BHX对Wnt通路关键蛋白β-catenin以及EMT相关蛋白E-cadherin、SNAIL和Vimentin的调控作用,并通过PCR技术检测SNAIL、Vimentin、β-catenin、E-cadherin的m RNA表达水平。结果:1.MTT实验结果表明BHX对MDA-MB-231细胞系增殖具有较好的抑制作用,且对正常乳腺上皮细胞细胞系MCF-10A的抑制作用较小;二维克隆形成实验结果证明BHX可以抑制乳腺癌细胞的克隆形成能力,并且具有明显量效关系;Transwell、划痕实验结果证明BHX可抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力;裸鼠皮下移植瘤实验及活体成像实验结果证明BHX在体内可以抑制移植瘤的生长,具有良好的抗肿瘤作用;2.流式细胞仪检测结果表明BHX可以使MDA-MB-231细胞系细胞周期发生阻滞,使其停滞在G0/G1期,使细胞内ROS产生量增加,还可以诱导细胞产生早期凋亡,且具有明显的量效关系;Western blot实验结果表明BHX可以使β-catenin、SNAIL、Vimentin表达量下降,使E-cadherin表达量升高;PCR实验证明BHX可以使SNAIL、Vimentin、β-catenin的m RNA表达量减少,使E-cadherin的m RNA表达量增加。结论:1.BHX具有较好的体内体外抗乳腺癌作用,且对正常人体细胞抑制作用较小。2.BHX通过抑制Wnt通路活性以及逆转EMT进程而发挥抑制乳腺癌增殖及转移的作用。
【图文】：

图 I BHX 降低 β-连环蛋白/T 细胞因子转录活性作用显著（利用测定细胞内 β-连环蛋白介导的转录活性的方法进行基因筛选，对 20 种先导化对 Wnt 通路信号的活性进行检测。1 号为 DMSO 对照组，9 号为 BHX。）2）BHX 的反应路线和工艺流程HX 反应路线和工艺流程简单、结构图谱分析明确，其合成量可以满足课题需要。下面是 BHX 的反应路线及工艺流程。

图 1 BHX 对细胞的增值抑制作用，横坐标为药物浓度（umol/L），纵坐标为抑制率（%）。A: BHX 作用于人正常乳腺上皮细胞 MCF-10A 和乳腺癌 MDA-MB-231 细胞 72 h 后的细胞抑制率；（#p＜0.05，##p＜0.01 vs control）B: BHX 对乳腺癌 MDA-MB-231 细胞作用 24、48、72 h 后的细胞抑制率情况；C: BHX 作用于乳腺癌 MDA-MB-231 细胞 24 h 后在 200 倍光学显微镜下观察到的细胞形态学的变化1.3.1.2 BHX 对于乳腺癌细胞 MDA-MB-231 细胞克隆形成的作用为证明 BHX 对乳腺癌细胞 MDA-MB-231 细胞克隆形成的影响，我们利用二维克隆形成实验的方法，研究 BHX 对于细胞 MDA-MB-231 细胞克隆形成的影响。如图 2 所示，结果显示，BHX 对 MDA-MB-231 克隆形成具有较明显抑制作用，，在显微镜下可以观察到药物可以影响肿瘤细胞相互聚集，使其分散不形成克隆体。随着药物浓度增加，细胞形成克隆数量百分比逐渐降低，说明药物对克隆形成的抑制率具有较明显的时间和浓度依赖性，以上结果表明，BHX 对肿瘤细胞克隆形成具有抑制作用。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965

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本文编号：2685132