尼克酰胺磷酸核糖转移酶在A549细胞发生上皮—间质转化中的作用

发布时间：2017-03-26 09:11

  本文关键词：尼克酰胺磷酸核糖转移酶在A549细胞发生上皮—间质转化中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景： 尼克酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase, NAMPT),是哺乳动物细胞尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)补救合成途径的限速酶,而NAD是细胞物质能量代谢的重要辅酶。研究发现,NAMPT与肿瘤的关系非常密切,相比于正常细胞,肿瘤细胞对物质、能量的需求更高,因而对NAMPT的需求也更高。临床研究发现,许多肿瘤患者血清中的NAMPT水平显著升高,且随着肿瘤恶性程度的加深而增加,与预后呈负相关。有研究者认为可以将患者血清中的NAMPT水平作为评估肿瘤恶性程度的生物标记物。还有研究发现,NAMPT能够促进人脐静脉内皮细胞增殖及管腔形成,通过诱导ERK通路(Extracellular regulated protein kinase, ERK)和基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMP2/9)的活化,促进血管增生,因而认为NAMPT对于肿瘤细胞的迁移有促进作用,这提示NAMPT与肿瘤的发生发展具有密切的联系。目前,NAMPT特异性抑制剂FK866已经进入Ⅱ期临床试验,FK866能通过特异性抑制NAMPT酶活性,使NAD的合成减少,从而导致肿瘤细胞死亡。研究者认为,FK866是极具应用前景的抗肿瘤药物。 肿瘤的侵袭与转移与多种因素有关,在恶性肿瘤的发展过程中,上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)是肿瘤发生侵袭和向远端转移的一个重要步骤。然而,NAMPT及其抑制剂FK866对肿瘤细胞的侵袭与转移是否有影响,却少有研究报道。本研究中,我们应用FK866抑制细胞NAMPT酶活性、细胞外直接给予NAMPT蛋白作处理因素,观察这些处理对非小细胞肺癌细胞株A549细胞发生EMT的影响,并初步探讨这些处理影响A549细胞发生EMT的机制。 研究目的： 观察尼克酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)抑制剂FK866及细胞外NAMPT在A549细胞发生EMT中的作用,并初步探讨以上处理影响A549细胞发生EMT的机制。 研究方法： 1.探讨抑制NAMPT酶活性对A549细胞发生EMT影响： (1)使用TGF-β1诱导A549细胞发生EMT,建立EMT模型；采用RT-qPCR方法检测FK866处理后,模型表达与EMT相关分子标记物E-cadherin、vimentin和α-SMA的mRNA的情况； (2)采用RT-qPCR方法检测A549细胞以FK866不同浓度不同时间作用后,表达EMT相关分子标记物E-cadherin、vimentin和α-SMA的mRNA的情况； (3)以RT-qPCR方法检测FK866作用后A549细胞的TGF-β1表达； (4)以NAMPT的底物NMN(模拟NAMPT酶活性增高)预处理A549细胞后,再以FK866给药处理,观察NMN能否逆转FK866引起的EMT相关分子的表达变化； (5)以Western blotting检测FK866处理A549细胞不同时间,细胞ERK1/2及p-ERK1/2的表达；并使用ERK抑制剂U0126预处理,以进一步确证ERK通路激活参与调控FK866引起的A549细胞发生EMT； (6)以RT-qPCR方法检测FK866作用后A549细胞中EMT转录因子Snaill, Slug, Twist的表达； 2.探讨细胞外NAMPT对A549细胞发生EMT的影响： (1)以基因重组的人NAMPT野生型蛋白、酶活性位点突变型蛋白(NAMPT/H247A)处理A549细胞,以TGF-β1为阳性对照,采用RT-qPCR检测细胞上皮化标记物E-cadherin,间质化标记物vimentin和a-SMA的表达。 (2)使用ERK抑制剂U0126预处理后,检测上皮化标记物E-cadherin,间质化标记物vimentin和a-SMA的表达情况。 (3)以基因重组的人NAMPT蛋白野生型、酶活性位点突变型蛋白NAMPT/H247A (500ng/ml)处理A549细胞,采用RT-qPCR检测细胞转录因子Snaill, Slug, Twist的表达。 研究结果： 1.抑制NAMPT酶活性可促进A549细胞发生EMT (1) TGF-β1浓度依赖和时间依赖的诱导A549细胞发生EMT; FK866预处理并未能抑制TGF-β1诱导的EMT； (2)单独使用FK866处理A549细胞后,细胞间质化标记物vimentin与a-SMA的mRNA表达呈时间依赖性的显著升高； (3)FK86610nM单独使用处理A549细胞后,细胞表达TGF-β1明显下降,表明较高浓度的FK866诱导细胞发生EMT其机制可能不涉及TGF-β1的上调表达； (4)NMN能够显著逆转FK866引起的EMT相关标记物的表达变化,提示FK866促进细胞发生EMT的机制涉及其对NAMPT酶活性的抑制； (5)随着FK866作用时间的延长,细胞p-ERK1/2的表达显著增加,且U0126预处理能够显著逆转FK866引起的EMT标记物vimentin和a-SMA的mRNA表达上调；提示FK866促进细胞发生EMT的机制涉及ERK通路激活； (6)FK866(1nM)处理A549细胞72h,可显著上调转录因子Snaill, Slug, Twist的表达,提示FK866促进细胞发生EMT的机制涉及EMT相关分子转录水平的调节。 2.细胞外NAMPT (eNAMPT)可促进A549细胞发生EMT (1)人基因重组的NAMPT蛋白野生型(500ng/ml)和酶活性位点突变型蛋白NAMPT/H247A (500ng/ml)处理均可引起A549细胞上皮标记物E-cadherin的mRNA的表达显著下降,间质化标记物vimentin的mRNA的表达显著增加； (2)ERK抑制剂U0126预处理能够显著逆转eNAMPT引起的E-cadherin和vimentin的mRNA表达变化； (3)人基因重组的NAMPT蛋白野生型及酶活性位点突变型蛋白(NAMPT/H247A)(500ng/ml)处理细胞后,转录因子Snail, Slug, Twist的表达均显著增加。 结论： 1.NAMPT酶活性抑制剂FK866可诱导A549细胞发生EMT,其作用机制涉及对NAMPT酶活性抑制、ERK通路激活以及EMT相关分子转录水平的调节。 2.细胞外较高浓度的NAMPT也可诱导A549细胞发生EMT,但其作用不依赖于NAMPT的酶活性,其作用机制也涉及ERK通路激活以及EMT相关分子转录水平的调节。
【关键词】：上皮-间质转化 A549细胞 肿瘤 NAMPT FK866
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 缩略词表13-15
• 1. 引言15-19
• 2. 实验材料19-24
• 3. 实验方法24-30
• 4. 实验结果30-61
• 5. 讨论61-66
• 参考文献66-72
• 综述72-84
• 参考文献80-84
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果84

【共引文献】

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