右美托咪啶镇静效应的分子机制及其对抗药物阿替美唑的药效学研究

发布时间：2020-06-04 07:37

【摘要】：右美托咪啶(dexmedetomidine,DMED)是作用于α_2-AR的高效、高选择性激动剂,因其具有镇静、镇痛、神经保护及抗伤害效应而广泛用于兽医学麻醉及临床麻醉,但临床上尚缺乏有效对抗DMED镇静效应的拮抗剂。α_2-AR受体激活后与百日咳毒素敏感的G_(i/o)型G蛋白偶联,使其解离为G_(αi/o)亚基和G_(βγ)亚基,其中G_(βγ)亚基除与G_α亚基结合外,还参与多种GPCR介导的信号转导和调节作用。目前有关G_(βγ)亚基及其下游信号分子如何影响G_(αi/o)亚基及其信号通路的报道较少,其对DMED镇静效应的影响也不清楚。本课题首先评价了α_2-AR激动剂DMED的镇静效应以及α_2-AR高选择性拮抗剂阿替美唑(atipamezole,ATI)对该效应的拮抗作用;其次研究了α_2-AR受体后信号通路影响DMED镇静作用的机制,明确G_(αi/o)-AC-cAMP通路在DMED诱导镇静中的重要作用,揭示G_(βγ)及其下游信号分子通过影响AC-cAMP通路和下游蛋白pERK、pCREB磷酸化参与调控DMED的镇静效应。研究目的本课题旨在研究DMED的镇静效应并对其拮抗剂ATI的药效学进行评价;明确DMED激活α_(2A)-AR产生镇静效应的受体后机制;揭示G_(αi/o)、G_(βγ)亚基及其下游信号分子参与调控DMED镇静效应的可能机制。研究内容与方法1、DMED镇静效应及ATI拮抗作用评价:采用大小鼠翻正反射行为模型、抓力模型、体温测量、血压测量等评价DMED诱导镇静的量效关系及ATI的拮抗作用。2、G蛋白G_(αi/o)、G_(βγ)亚基及其下游信号分子对DMED镇静效应的影响:观察侧脑室注射G_(αi/o)/G_(βγ)亚基及下游信号分子激活剂或抑制剂对DMED诱导小鼠翻正反射行为消失的影响。3、G_(αi/o)、G_(βγ)亚基及其下游信号分子对DMED镇静作用影响的可能机制:构建CHO-α_(2A)-AR稳转细胞,通过分析胞内α_(2A)-AR mRNA和蛋白表达情况筛选细胞株;通过检测DMED作用后胞内cAMP含量变化验证受体功能。在此基础上,观察DMED和G_(βγ)亚基下游信号分子激活剂或抑制合并给药对Forskolin(FSK)激活AC后增强cAMP含量的影响,以及对胞内钙离子浓度([Ca~(2+)]i)的影响。另外,采用Western-Blot法检测胞内pERK、pCREB的变化。研究结果1、α_2-AR激动剂镇静与毒性效应评价DMED(0.10~0.32 mg·kg~(-1))可剂量依赖性诱导小鼠翻正反射行为消失,不同给药方式的ED_(50)分别为0.15 mg·kg~(-1)(i.v.)和0.18 mg·kg~(-1)(s.c.)。镇静剂量下,DMED剂量依赖性延长制动时间,诱导时间无显著差异;另外,美托咪啶(medetomidine,MED)镇静效应与DMED相似,不同给药方式的ED_(50)分别为0.28 mg·kg~(-1)(i.v.)和0.34 mg·kg~(-1)(s.c.),其效应约为DMED的0.5倍。在大鼠翻正反射行为模型中,DMED和MED产生镇静效应的ED_(50)分别为11.71μg·kg~(-1)(i.v.)和26.58μg·kg~(-1)(i.v.)。在小鼠急性毒性模型中,DMED的LD_(50)为26.73mg·kg~(-1)(i.v.),安全指数(LD_1/ED_(99))为14,提示DMED的安全窗口较大。2、ATI对DMED诱导镇静的拮抗作用及毒性效应评价根据DMED诱导镇静的量效关系曲线,选择0.20 mg·kg~(-1)(ED_(99))和0.80mg·kg~(-1)(4倍ED_(99))作为后续诱导大、小鼠翻正反射行为消失的造模剂量。在小鼠模型中,ATI(0.005~0.05 mg·kg~(-1))剂量依赖性拮抗0.20 mg·kg~-11 DMED的镇静效应,ED_(50)为12.44μg·kg~(-1);ATI(0.05-0.4 mg·kg~(-1))剂量依赖性拮抗0.80mg·kg~(-1)DMED产生的镇静效应,ED_(50)为0.17 mg·kg~(-1)。在大鼠模型中,ATI对抗0.20 mg·kg~-11 DMED镇静效应的ED_(50)为0.06 mg·kg~(-1);0.05 mg·kg~(-1) ATI即可产生显著的催醒作用,0.15 mg·kg~(-1) ATI的催醒率为100%。另外,ATI还可剂量依赖性地拮抗DMED致小鼠低体温和肌松作用,逆转DMED致大鼠血压下降作用。在大、小鼠急性毒性实验中,ATI的LD_(50)分别为47.57 mg·kg~(-1)(i.m.)和49.47mg·kg~(-1)(i.m.),提示ATI的安全窗口较大。3、DMED诱导镇静效应的分子机制(1)G_(αi/o)-AC-cAMP-PKA通路分子对DMED镇静效应的影响DMED(100~900 nmol/kg,i.v.)剂量依赖性升高小鼠翻正反射消失率,ED_(50)为193.70 nmol/kg。cAMP类似物dbcAMP(50 nmol/5μl/只,i.c.v.)和PDE4抑制剂rolipram(100 nmol/5μl/只,i.c.v.)提前15 min给药,显著降低DMED致小鼠翻正反射消失率,使量效曲线右移,ED_(50)分别升至375.0和433.3 nmol/kg。PKA抑制剂H89(20 nmol/5μl/只,i.c.v.)提前15 min给药,可增强DMED镇静效应,使其量效曲线左移,ED_(50)降至163 nmol/kg。dbcAMP、rolipram和H89单独给药对小鼠翻正反射行为无影响。(2)G_(βγ)亚基及下游信号分子对DMED镇静效应的影响G_(βγ)亚基抑制剂gallein(100 mg/kg,i.v.)和M119(100 mg/kg,i.v.)提前15 min给药,可增强DMED镇静效应,使其量效曲线左移,ED_(50)分别降低到136.5和113.6 nmol/kg。PLC抑制剂U73122(10 nmol/5μl/只,i.c.v)和PKC抑制剂GF109203X(242 pmol/5μl/只,i.c.v)提前15 min给药,可增强DMED镇静效应,使其量效曲线左移,ED_(50)分别降至42.5、110.1和85.2 nmol/kg。GRK抑制剂β-ARK1inhibitor(10 nmol/5μl/只,i.c.v.)和MEK抑制剂PD98059(10 nmol/5μl/只,i.c.v)对DMED镇静效应无明显影响。(3)G_(βγ)亚基介导DMED镇静效应机制(1)CHO-α_(2A)-AR稳定转染细胞株构建puro-pCDH-α_(2A)-AR重组质粒转染CHO细胞后,经G418(200 mg/kg)压力筛选获得6株呈α_(2A)-AR阳性表达的CHO-α_(2A)-AR细胞。通过检测DMED合用FSK处理后胞内cAMP含量变化,筛得3号细胞用于后续实验。(2)G_(βγ)下游信号分子抑制剂对胞内cAMP含量的影响5μMβARK1抑制剂、G_(βγ)亚基抑制剂gallein、PKC抑制剂GF109203X持续处理CHO-α_(2A)-AR细胞1小时后抑制FSK(10μM)引起的胞内cAMP含量升高;G_(βγ)亚基抑制剂M119、PLC抑制剂U73122、MEK抑制剂PD98059对FSK引起的cAMP含量升高无影响。上述化合物对DMED抑制FSK升高胞内cAMP含量的效应无显著影响。(3)G_(βγ)下游信号分子抑制剂对[Ca~(2+)]i的影响DMED(5μM)、G_(βγ)亚基抑制剂gallein和M119(5μM)对胞内钙离子浓度([Ca~(2+)]i)无显著影响;DMED(5μM)与G_(βγ)亚基抑制剂gallein或M119(5μM)合用时可显著增强胞内钙离子浓度([Ca~(2+)]i)。(4)G_(βγ)下游信号分子抑制剂对pERK表达的影响DMED(5μM)随时间延长显著上调胞内pERK的表达,1 min开始升高,5 min达到峰值,60 min与对照组比较无显著差异。G_(βγ)亚基抑制剂gallein(5μM)持续作用5-30 min显著增强pERK表达,且显著增强DMED(5μM)引起的pERK上调,延长上调时间。G_(βγ)亚基抑制剂M119产生与gallein相似的作用。PKC抑制剂GF109203X(5μM);βARK1抑制剂(5μM)对pERK表达无影响,但显著增强DMED(5μM)引起的pERK上调。(5)G_(βγ)下游信号分子抑制剂对pCREB表达的影响DMED(5μM)可显著增强胞内pCREB表达,5 min开始升高,15 min达到峰值,60 min与对照组比较无显著差异。G_(βγ)亚基抑制剂gallein(5μM)、M119(5μM)可显著增强pCREB表达,并增强DMED引起的pCREB上调;βARK1抑制剂、PKC抑制剂GF109203X、MEK抑制剂PD98059(5μM)对pCREB表达无影响,但能够增强DMED(5μM)引起的pCREB上调。(4)G_(αi/o)-cAMP-PKA通路影响DMED镇静效应的机制dbcAMP和rolipram(5μM)对胞内pERK、pCREB表达无影响,但都能显著抑制DMED(5μM)引起的pERK上调,不影响DMED(5μM)引起的pCREB上调。1、ATI可有效拮抗DMED的强镇静效应及其所致低体温、肌松、低自发活动和低血压等副作用,安全性较高,可开发为临床α_2-AR拮抗剂。2、DMED激活α_(2A)-AR后,通过抑制G_(αi/o)-AC-cAMP通路,降低胞内cAMP含量引起镇静效应;同时通过增强G_(βγ)亚基相关信号通路直接或间接影响胞内cAMP含量、[Ca~(2+)]i、ERK和CREB磷酸化程度,调节镇静效应。3、pERK正向调节DMED镇静效应;pCREB可以作为DMED及相关分子发挥镇静效应的下游标志蛋白。
【图文】：

效应,小鼠,翻正反射,时长

2A dbcAMP 对 DMED 介导镇静效应的低 DMED 致小鼠翻正反射消失，**P<0.01，*P<OVA 及 Tukey’s test，n=10.dbcAMP 对 DMED 介导镇静效应的诱导时长 DMED（400，600 nmol/kg）引起的小鼠翻 DMED 组相比较；Mean±SEM，Two-way AN

翻正反射,诱导时间,小鼠,效应

bcAMP 对 DMED 介导镇静效应的诱导长 DMED（400，600 nmol/kg）引起的小鼠翻DMED 组相比较；Mean±SEM，，Two-way ANP 对 DMED 引起的小鼠翻正反射消失制动起的小鼠翻正反射消失制动持续时间无显著影NOVA 及 Tukey’s test， n=10.
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965

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