倍半萜内酯类肠上皮钙激活氯离子通道抑制剂的发现及分子药理学机制研究

发布时间：2020-06-05 06:33

【摘要】：钙激活氯离子通道(Calcium-activated chloride channels,CaCCs)是许多细胞功能的基础,是参与多种重要生理过程的质膜蛋白。在肠动力调控、平滑肌收缩、上皮液体转运、神经元兴奋和伤害感受等多种生理过程起着重要的调节作用。选择性调节剂的研究可为揭示多种生理病理过程中CaCCs的作用机制和分子身份提供理论基础。所以筛选高亲和力、选择性强的CaCCs抑制剂成为了重点研究对象。结肠癌细胞系HT-29内源表达TMEM16A和一种分子身份未知的肠上皮CaCC,本研究利用HT29/YFP-H148Q/I152L作为筛选模型,从天然小分子化合物中筛选出对肠上皮CaCC有抑制作用的药物,发现了木香烯内酯(Costunolide,Cos)、去氢木香烃内酯(Dehydroxylinolactone,Dehy)、土木香内酯(Alantolactone,AL)、异土木香内酯(Isoalantolactone,iAL)可抑制肠上皮CaCC,并利用细胞生物学实验及电生理手段对化合物的选择性、作用机理和分子药理学进行探究;在小鼠体内,对抑制剂的体内活性进行分析。本研究的目的是从天然产物中筛选亲和力好,靶向性强的肠上皮CaCC抑制剂,并对其进行分子药理学研究,为揭示肠上皮CaCC的分子身份提供理论依据。实验结果:1.利用HT29/YFP-H148Q/I152L作为测定模型,发现了倍半萜内酯类化合物木香烯内酯、去氢木香烃内酯、土木香内酯、异土木香内酯在HT-29细胞上均以剂量依赖的方式抑制肠上皮CaCC,表观IC_(50)值分别为21.6μM、25.3μM、28.5μM与29.8μM,且其抑制作用均具有可逆性特点。2.HT-29短路电流实验结果显示四种倍半萜内酯类化合物均抑制肠上皮CaCCs,且呈剂量依赖关系。四种倍半萜内酯类化合物IC_(50)值分别约为24.7μM、12.5μM、5.3μM与9.2μM。3.Ca~(2+)浓度实验结果表明四种倍半萜内酯类化合物对由ATP,CCh及ionomycin引起的HT-29细胞内Ca~(2+)浓度升高均有抑制作用。4.FRT-TMEM16A细胞短路电流实验结果显示,四种倍半萜内酯类化合物均抑制TMEM16A氯离子通道电流,且呈剂量依赖方式。IC_(50)值分别约为18.9μM、55.4μM、34.2μM与38.5μM。实验结果显示四种倍半萜内酯类化合物对TMEM16A抑制作用的浓度范围与对HT-29细胞上的CaCCs的不同。5.T84细胞短路电流实验结果显示,四种倍半萜内酯类化合物在细胞顶膜侧均以剂量依赖的方式抑制CFTR氯离子通道,IC_(50)值分别约约为20.3μM、9.5μM、11.1μM与14.6μM。6.小鼠结肠组织粘膜短路电流结果显示四种倍半萜内酯类化合物对小鼠结肠组织粘膜CFTR和小鼠结肠浆膜侧Na~+-K~+-ATPase没有抑制作用。7.小鼠结肠浆膜短路电流结果显示四种倍半萜内酯类化合物对K~+通道有一定抑制作用。8.小鼠结肠粘膜短路电流实验结果显示四种倍半萜内酯类化合物对小鼠结肠组织粘膜氯离子通道以剂量依赖的方式发挥抑制作用。在体内实验中,结果显示四种倍半萜内酯类化合物能够抑制小鼠肠蠕动。新生小鼠轮状病毒腹泻模型实验结果显示土木香内酯和异土木香内酯均对轮状病毒引起的分泌性腹泻有抑制作用,且土木香内酯作用效果优于异土木香内酯。结论:本研究发现了四种倍半萜内酯类化合物木香烯内酯、去氢木香烃内酯、土木香内酯、异土木香内酯对CaCC、TMEM16A和K~+通道有抑制活性,且四种倍半萜内酯类化合物对TMEM16A其抑制作用的剂量浓度范围与其对HT-29细胞上的CaCCs的剂量浓度范围不同,HT-29细胞上内源性表达TMEM16A和一种分子身份未知的肠上皮CaCC,因此可确定四种倍半萜内酯类化合物对肠上皮CaCC有抑制作用。四种倍半萜内酯类化合物也可抑制细胞内的钙离子浓度,因此四种倍半萜内酯类化合物可能是以抑制Ca~(2+)为靶点发挥其对CaCCs和K~+通道抑制作用的。四种倍半萜内酯类化合物也可抑制CaCC介导的液体分泌和肠蠕动。该发现为分泌性腹泻的致病机理及治疗提供了理论基础,同时为揭示肠上皮CaCC的分子身份的确定提供了理论依据。
【图文】：

倍半萜内酯类肠上皮钙激活氯离子通道抑制剂的发现及分子药理学机制研究a+/K+-ATPase 产生的 Na+梯度介导 Cl 通过基底外侧膜的摄取。因此，Cl 的静息膜电位，从而有利于 Cl 通过顶膜侧的通道分泌。研究证明 NKCC1 基在上皮细胞中分泌 Cl 的能力下降[73-75]。Cl-的分泌还基于基底外侧 K+通道维持细胞膜负电位非常重要。CaCCs 的 Cl 分泌也依赖于参与离子转运的蛋白的协同作用。在静息状态下，许多类型的上皮细胞的顶膜都有上皮细ENaC)，它驱动上皮细胞的液体的吸收。钠离子的流入使膜去极化，从而为造了条件。因此，，CaCCs 分泌 Cl 需要平行封闭 ENaC。研究发现嘌呤碱作皮细胞会对 CaCCs 和 ENaC 分别产生刺激和抑制作用[76,77]。

倍半萜内酯类肠上皮钙激活氯离子通道抑制剂的发现及分子药理学机制研究aMKII 磷酸化产生抑制作用[106,107]。这种机制解除了细胞内 Ca2+瞬时变化aCC 活化的耦连作用:当细胞受到刺激时，Cl 电导达到峰值，但随后下降速度 Ca2+浓度[105]。磷酸化引起的抑制机制被钙调磷酸酶的去磷酸化所抵消[108,109
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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本文编号：2697658