阿托伐他汀在炎症状态下诱导肝脏胰岛素抵抗及机制探讨

发布时间：2020-06-05 11:15

【摘要】：目的:他汀类药物作为心血管疾病的一、二级预防药物,其在临床的广泛应用大大降低心血管疾病的发病率,降低心血管疾病的死亡率。然而越来越多的研究表明:他汀类药物的应用与新发2型糖尿病相关,但其致病机制尚不完全明确。炎症作为独立因素可以导致胰岛素抵抗,是否炎症可能成为他汀类药物导致糖尿病的致敏因素,即在炎症状态下他汀可能导致胰岛素抵抗,非炎症状态下他汀不会诱发胰岛素抵抗。由于肝脏胰岛素抵抗,在糖尿病形成过程中作用显著,故本研究重点研究肝脏胰岛素抵抗。炎症可能通过诱发肝脏产生过多的活性氧导致胰岛素抵抗,本研究进一步探讨他汀类药物是否可能在炎症基础上进一步增加了活性氧尤其是线粒体活性氧的生成。由于他汀类药物可以调整肝脏细胞胞内胆固醇代谢,而炎症也对细胞内胆固醇代谢平衡存在作用,胞内胆固醇特别是线粒体胆固醇的异常堆积可以导致线粒体功能失调,生成过量的线粒体活性氧,最终诱发胰岛素抵抗,而细胞内过量的胆固醇可通过START结构域蛋白3(Stard3)转运至线粒体,当线粒体无法代谢处理过量胆固醇时,胆固醇随即堆积于线粒体。本研究拟探讨他汀是否在炎症背景下通过上调的Stard3蛋白转运至肝脏细胞线粒体导致线粒体胆固醇集聚,最终诱发肝脏胰岛素抵抗。方法:第一部分,临床数据:收集内分泌科2型糖尿病患者,糖尿病诊断时间大于等于1年,且血糖控制稳定。排除慢性病毒性肝炎、自身免疫性肝脏疾病、遗传性肝脏疾病、急性感染期患者,且所有入选患者每日酒精摄入量均小于等于20g。采集患者基本资料(性别、年龄等)及肝脏超声结果、体重、身高、肝功能、血脂、空腹血糖及糖化血红蛋白。根据患者CRP值将患者分为炎症组(CRP≥10mg/L or hsCRP≥3mg/L)及非炎症组(CRP10mg/L or hsCRP3mg/L),再根据患者是否服用他汀类药物将上述两组各分为两个亚组,即非炎症不服用他汀组,非炎症服用他汀组;炎症不服用他汀组,炎症服用他汀组。第二部分:动物实验:通过喂养Apo E~(-/-)小鼠(雄性)西方饮食共8周,建立小鼠高胆固醇血症模型,酪蛋白(casein)注射模拟炎症状态,动物分组:对照组:隔日皮下注射0.9%生理盐水0.5ml;2)阿托伐他汀组:隔日皮下注射0.9%生理盐水0.5ml,阿托伐他汀10mg/kg/d口服;3)casein组:隔日皮下注射10%酪蛋白0.5ml;4)casein+阿托伐他汀组:隔日皮下注射10%酪蛋白0.5ml,阿托伐他汀10mg/kg/d口服。小鼠血清炎症坏死因子α(TNFα)及白介素-6(IL-6)测定采用酶联免疫吸附实验(ELISA),血清自动生化仪测定小鼠血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(FC)、甘油三酯(TG)。肝脏组织切片HE染色观察肝脏脂肪样变程度。肝脏组织总胆固醇(TC)及游离胆固醇(FC)测定采用酶学方法检测。肝组织甘油三酯含量采用酶偶联比色法测定。Western blot测定小鼠肝脏组织胰岛素受体底物-1(IRS-1)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)、肝脏葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B(p-Akt/Akt)、含START结构域蛋白1(Stard1)和含START结构域蛋白3(Stard3)的蛋白表达。RT-PCR测定stard1、stard3至stard6基因表达。肝组织新鲜冰冻切片进行DHE染色了解肝脏组织中超氧阴离子生成情况。第三部分,细胞实验:将Hep G2细胞分为4组处理组:对照组(含0.5%BSA的DMEM培养基+LDL),阿托伐他汀组(含0.5%BSA的DMEM培养基+LDL+阿托伐他汀),TNFα组(含0.5%BSA的DMEM培养基+LDL+TNFα),TNFα+阿托伐他汀组(含0.5%BSA的DMEM培养基+LDL+TNFα+阿托伐他汀),以上共处理24小时。油红O细胞染色了解不同处理条件下脂质沉积情况。细胞及线粒体总胆固醇(TC)及游离胆固醇(FC)测定采用酶学方法检测。采用胆固醇类似物(TopFluor cholesterol)摄入细胞后与细胞线粒体共染,分析不同处理条件下细胞线粒体胆固醇分布情况。采用DHE染色分析细胞内ROS生成情况,采用膜电位依赖的mito tracker测定线粒体膜电位情况,采用Mito SOX测定线粒体ROS产生情况。在HepG2细胞上si RNA干扰stard3表达后再次进行线粒体胆固醇沉积、线粒体ROS产生、线粒体膜电位测定。结果:第一部分:在非炎症组(CRP10mg/L or hsCRP3mg/L),他汀类药物降低患者血TC及LDL(P0.05),对患者糖化血红蛋白、空腹血糖及脂肪肝发病率无明显影响(P0.05);而在炎症组(CRP≥10mg/L or hsCRP≥3mg/L),他汀类药物显著升高患者糖化血红蛋白、空腹血糖值及脂肪肝发病率(P0.05),虽然本组中血TC及LDL呈下降趋势,但差异无统计学意义(P0.05)。第二部分小鼠葡萄糖耐量及胰岛素耐量实验中,对照组与阿托伐他汀组比较两者无统计学差异;而casein组与casein+阿托伐他汀组相比,casein+阿托伐他汀组葡萄糖耐量下降,胰岛素敏感性降低。在炎症状态下,阿托伐他汀破坏胰岛素信号通路(IRS-1,p-AKT/AKT),同时肝脏G6Pase表达增高,并上调Stard3蛋白表达,显著增加肝脏甘油三酯及游离胆固醇水平(P0.05),还增加了小鼠肝脏组织ROS产生;而非炎症状态下,阿托伐他汀对上述指标无明显影响。第三部分在炎症状态下(TNFα处理),阿托伐他汀显著增加了细胞TC及FC含量及线粒体FC含量(P0.05),增加了TopFluor cholesterol进入线粒体,增加细胞总ROS生成,降低线粒体膜电位及增加线粒体ROS生成(P0.05)。而在非炎症状态下,阿托伐他汀并未改变上述指标。将stard3基因在HepG2细胞沉默后,炎症状态下,阿托伐他汀对于线粒体内胆固醇聚集、线粒体ROS产生及线粒体膜电位,Pepck表达均无明显影响。结论:炎症状态下,阿托伐他汀明显降低小鼠肝脏胰岛素信号通路,增加肝脏糖异生及肝脏脂质沉积及肝脏组织ROS生成,阿托伐他汀通过调整细胞胞内胆固醇含量及线粒体游离胆固醇含量,进而增加线粒体胆固醇并增加线粒体ROS生成,而非炎症状态下阿托伐他汀不存在该作用。
【图文】：

图 2.2ApoE-/-小鼠肝脏血脂测定igure 2.2 The level of hepatic FC、CE、TG in ApoE-/-mice或阿托伐他汀对ApoE-/-小鼠FC、CE、TG的影响。数据以均数±标准差表示（P<0.05 与 casein 组比较。atic FC、CE、TG in ApoE-/-mice after casein injection and/or atorvastatin. ResP<0.05 versus control group,#P<0.05 versus casein group.汀在炎症/非炎症状态下对 ApoE-/-小鼠胰岛素耐响葡萄糖耐量及胰岛素耐量结果参见图 2.3，，在非炎症与对照组相比，阿托伐他汀未显著改变小鼠各个时间

图 2.3ApoE-/-小鼠葡萄糖耐量及胰岛素耐量Figure 2.3 Glucose and insulin tolerance in ApoE-/-mice阿托伐他汀在炎症/非炎症状态下对 ApoE-/-小鼠（A）葡萄糖耐量及（B）胰岛素耐量的影响。数据以均数±标准差 (n=5)表示。*P<0.05 与对照组比较，#P<0.05 与 casein 组比较。A. Glucose tolerance tests (GTT) performed after 8 weeks treatment. B. Insulin tolerance tests( ITT) performedat the end of the experiment.Data are depicted as mean±SD (n=5).*P<0.05 versus control group.#P<0.05 versuscasein group.2.4 阿托伐他汀在炎症/非炎症状态下对 ApoE-/-小鼠肝脏胰岛素信号通路蛋白表达的影响
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96

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本文编号：2697968