丁苯酞抗白色念珠菌的体内外作用及机制研究

发布时间：2020-06-06 16:48

【摘要】：背景:白色念珠菌(Candida albicans,C.albicans,CA)是常见的造成侵袭性真菌血流感染的条件致病菌。近年来,由于三唑类等传统抗真菌药物的广泛使用,耐药的白色念珠菌的分离率不断升高,给白色念珠菌感染的治疗带来了极大的挑战。丁苯酞(n-butylphthalide，NBP)是芹菜籽油的主要成分之一,临床上主要用于治疗急慢性脑卒中。目前仅有文献报道同为芹菜籽提取物的其它丁苯酞结构类似物具有抗念珠菌活性,尚无关于丁苯酞抗真菌活性的研究报道。目的:评价丁苯酞在体内和体外对白色念珠菌的抗真菌作用,并探讨其潜在的抗真菌机制。方法:采用标准微量肉汤稀释法测定丁苯酞单用及与氟康唑(Fluconazole,FLC)联用对白色念珠菌浮游菌的作用,用分级抑菌浓度指数(Fractional inhibitory concentration index,FICI)评价两药联用的相互作用结果;采用比色法测定丁苯酞对预先形成的不同阶段生物膜的作用;通过绘制时间杀菌曲线,评估丁苯酞对白色念珠菌的动态抗真菌作用。采用大蜡螟-白色念珠菌侵染模型,通过测定感染大蜡螟幼虫的生存率、体内真菌载菌量和组织病理学变化，评价丁苯酞的体内抗真菌作用。采用卵黄培养基测定白色念珠菌胞外磷脂酶活性,显微镜观察菌丝形态转换,评价丁苯酞干预后白色念珠菌毒力因子的变化;采用荧光探针DCFH-DA和罗丹明123测定丁苯酞干预后白色念珠菌胞内活性氧水平和线粒体膜电位;采用荧光探针罗丹明6G,测定丁苯酞对白色念珠菌药物转运蛋白活性的影响,探讨丁苯酞和氟康唑协同抗真菌机制。结果:(1)丁苯酞单用具有抗白色念珠菌作用,与氟康唑联用对耐药白色念珠菌具有协同抗真菌作用丁苯酞对实验所用的六株白色念珠菌均表现出抗真菌作用,MIC值均为128μg/mL。当与氟康唑合用时,丁苯酞可将耐药白色念珠菌对氟康唑的MIC值从512 μg/mL降至0.25-1 μg/mL，，FICI值均0.5,表现出强烈的协同作用。随后,时间杀菌曲线证实了丁苯酞对白色念珠菌的动态抗真菌作用。(2)丁苯酞单用具有抗白色念珠菌预形成生物膜的作用,与氟康唑联用对耐药白色念珠菌预形成的生物膜具有协同抗真菌作用丁苯酞对预形成时间不超过12 h的生物膜具有抑制作用,sMIC值为128-256μg/mL,但对预形成24 h的生物膜没有活性。此外,和氟康唑联用时,对于耐药白色念珠菌预形成时间不超过12h的生物膜,丁苯酞可将其对氟康唑的sMIC值从1024μg/mL降至0.5-8μg/mL,FICI值均0.5,表现出强烈的协同作用。但两药联用对敏感白色念珠菌形成的各阶段的生物膜和所有白色念珠菌预形成24 h的成熟生物膜表现为无关作用。(3)丁苯酞和氟康唑联用对白色念珠菌感染的大蜡螟幼虫具有协同抗真菌作用丁苯酞单用即可对白色念珠菌感染的大蜡螟幼虫表现出一定的体内抗真菌作用,然而,当丁苯酞和氟康唑联用时,治疗作用明显增强。药物联用可显著提高感染后的大蜡螟幼虫的生存率,减少幼虫体内的真菌载菌量,减弱白色念珠菌对幼虫组织的病理学损伤。说明丁苯酞可以逆转感染白色念珠菌后的幼虫对氟康唑的耐药性,表现出体内协同抗真菌作用。(4)丁苯酞减弱白色念珠菌的毒力因子丁苯酞可以显著降低白色念珠菌胞外磷脂酶活性，使白色念珠菌由分泌极高活性的磷脂酶转变为分泌低活性的磷脂酶。此外,丁苯酞还可以抑制白色念珠菌由酵母相向菌丝相的形态转换,且随着浓度的升高,抑制作用逐渐增强。说明丁苯酞通过减弱白色念珠菌毒力因子进而发挥抗真菌作用。(5)丁苯酞引发白色念珠菌胞内活性氧蓄积以及降低线粒体膜电位随着丁苯酞药物浓度的升高,白色念珠菌胞内活性氧水平升高,同时,线粒体膜电位下降,具有低线粒体膜电势的白色念珠菌细胞比例显著增多。说明丁苯酞通过诱发胞内活性氧蓄积,造成线粒体膜电位去极化进而发挥抗真菌作用。(6)丁苯酞抑制白色念珠菌药物转运体的活性丁苯酞显著促进白色念珠菌对氟康唑的吸收,抑制细胞膜上药物转运体的活性。使胞内氟康唑外排减少,提高白色念珠菌胞内氟康唑的浓度,进而和氟康唑联用对白色念珠菌发挥协同抗真菌作用。结论:丁苯酞具有在体外抑制白色念珠菌浮游菌及预形成的生物膜的活性的作用,且和氟康唑合用发挥协同抗真菌活性。此外,丁苯酞和氟康唑联用可延长白色念珠菌感染的大蜡螟侵染模型幼虫的生存率,降低幼虫体内真菌载菌量以及减少白色念珠菌对幼虫组织的损伤,表现出体内抗真菌活性。机制研究表明,丁苯酞抗白色念珠菌作用与减弱白色念珠菌重要毒力因子,包括磷脂酶活性和菌丝形态转换,诱发胞内活性氧聚集和线粒体膜电位降低以及抑制药物转运泵活性有关。
【图文】：

假菌丝,白色念珠菌,母相,生物膜

（图１）邋［８］。当菌体黏附于宿主后，菌体出芽形假菌丝宽度比菌丝窄且菌丝体中无缢痕［９，１Ｄ］。白色念珠菌可以获得营养，同时菌丝或假菌丝侵袭性和传染性都会增加，加剧了对宿主细胞染宿主时，易在器官表面形成生物膜。生物膜有天然抗性，不易被清除，而白色念珠菌菌丝形成的过程往往也伴随着生物膜的形成［８］，因形态转换也是白色念珠菌致病性产生的重要毒

氟康唑,念珠菌,联用,白色念珠菌

本部分实验以耐药白色念珠菌ＣＡ１０为代表菌株。以不同时间不同体系的菌逡逑液浓度为纵坐标，以时间为横坐标，用ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉＳｍ７软件绘制丁苯酞单用及逡逑与氟康唑联用对耐药白色念珠菌ＣＡ１０的时间杀菌曲线（图３）。逡逑ａ逦ｂ逡逑８－１邋８－１逡逑夺邋Ｃｏｎｔｒｏｌ逦令邋Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑Ｌｊ邋７－逦＾逦？邋６４ｐｇ／ｍＬ逦Ｌ邋７－逦＾逦、’ＢＰ逡逑＝逦１２８Ｍｇ／ｍＬ逦＝逦ＦＬＣ逡逑＆邋６＇邋Ｊ逦－＊■邋２５６Ｍｇ／ｍｌ．逦＆邋６．邋／Ｔ逦ＮＢＰ＋ＦＬＣ逡逑｜５＜＾￣逦邋１－＾—逦逦．逡逑０逦１２逦２４逦３６逦４８逦０逦１２逦２４逦ｉ６逦４８逡逑Ｔｉｍｅ（ｈ）逦Ｔｉｍｅ（ｈ）逡逑图３邋丁苯酞单用（ａ）及和氟康唑联用（ｂ）对白色念珠菌ＣＡ１０的时间杀菌曲线。菌悬液逡逑浓度为１0５邋ＣＦＵ／ｍＬ。（ａ）丁苯酞单用时，浓度分别为６４，邋１２８和２５６邋ｎｇ／ｍＬ。（ｂ）丁苯酞和氟逡逑康唑联用时，浓度分别为１２８和１邋（ｉｇ／ｍＬ。（见实验记录０００５５１３ｐ３４－ｐ３５，邋ｐ３８－ｐ３９，邋ｐ４１－ｐ４２，逡逑ｐ６７－ｐ６８）逡逑由图可知，丁苯酞单用时，当药物浓度为６４和１２８邋Ｍｇ／ｍＬ，白色念珠菌时逡逑间生长曲线基本与生长对照组重合，但当丁苯酞浓度提高至２５６邋ｐｇ／ｍＬ，培养６邋ｈ逡逑后，白色念珠菌的生长明显被抑制。和生长对照组相比，２５６邋ｐｇ／ｍＬ邋丁苯酞可使逡逑２４和４８邋ｈ的菌液浓度分别减少１．９１邋ｌｇｌＯ和２．０５邋ｌｇｌＯ邋ＣＦＵ／ｍＬ。对于药物联用组，逡逑浓度为１邋ｐｇ／ｍＬ的氟康唑药液略抑制白色念珠菌的生长
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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