基于质谱的糖蛋白药物复杂糖修饰结构解析方法研究与应用

发布时间：2020-06-06 17:02

【摘要】：糖蛋白药物的糖修饰包括糖基化修饰和糖化修饰,对糖蛋白药物的安全性、稳定性、免疫原性及生物学活性等有重要影响,与许多疾病的发生发展密切相关,因此糖蛋白药物糖修饰研究具有重要意义。由于不同糖蛋白药物的糖修饰复杂性不同,目前对糖修饰的全面研究仍是个巨大的挑战,为此针对不同糖蛋白药物的糖修饰开发全面解析策略是十分必要的。本论文从完整蛋白、糖肽及糖链水平等多个角度对糖蛋白药物糖基化修饰和糖化修饰及其对电荷异质性的影响进行了研究。第一章,首先介绍了糖蛋白药物的现状、糖修饰分类及其重要性,其次对常用的糖基化修饰含量、位点及糖型研究方法和糖化修饰研究策略进行了概述。第二章,以BSA为标准品建立“准内标法”,BSA多电荷峰RSD均≤0.075%,批间RSD为0.001%~0.004%,方法误差均0.01%,说明该检测方法准确性好,可靠性高,利用该方法实现了对rhTPO中N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖相对含量的准确测定,生物类似药分别为24.6%、2.9%、9.0%和5.1%,原研药分别为25.6%、2.9%、7.9%和3.5%,该方法不仅排除了标准品的干扰还提高了测定准确度,在应用于复杂糖蛋白的一致性分析方面有明显优势;根据完整含糖分子量分析8种单抗的主要N-糖糖型均为G0F/G0F和G0F/G1F,己糖指数(HexI)在0.2~1.6之间,HexI越低,G0F/G0F相对比例越高,HexI越高,G0F/G0F相对比例降低而G0F/G1F、G1F/G1F和G1F/G2F相对增加,己糖指数能良好的反映抗体药物的基础糖型分布,可作为发酵工艺优化和糖型质量控制的重要参数。此外,我们提出了唾液酸指数(SAI)这一概念,并应用于单抗唾液酸糖型分析和电荷异构体分析,3批单抗SAI在0.016~0.019之间,批间一致性良好。上述完整蛋白层次分析糖蛋白糖修饰一致性的新概念和新方法对于糖蛋白药物快速质量评价具有重要参考价值。第三章,为分析复杂糖蛋白药物的糖位点,本研究结合串联质谱从糖肽水平分析重组人促红细胞生成素(rhEPO)和rhTPO N-糖和O-糖修饰位点。成功鉴定rhEPO三个N-糖位点(N24、N38、N83)和一个O-糖位点(S126),得分均大于700分,鉴定结果可靠,采用“检出次数法”和“离子强度法”分析各位点糖基化率均证实N38最高,其次是N24,而N83最低,两种方法得到的总糖基化修饰率均大于65%,方法间和批间一致性良好;成功鉴定rhTPO五个N-糖位点(N176,N185,N213,N234和N327),鉴定得分均大于300分,均非常可靠,两种方法分析各位点修饰率均证实N176和N185最高,其次是N234和N327,而N213最低,总糖基化修饰率均大于75%,方法间和批间一致性良好,此外,根据rhTPO的O-糖糖型得到57个O-糖位点,S106位点相对比例为49%,明显高于其他位点,是rhTPO最主要的O-糖基化修饰位点。糖基化修饰率分析为复杂糖蛋白药物的批间比对研究提供了一种简单有效的方法。除此之外,本研究还通过O~(18)标记成功鉴定地诺单抗N-糖糖位点N298,得分949分,鉴定结果非常可靠,该方法有效的避免了碱性环境引起的自发脱氨基造成的假阳性,有利于后续复杂糖蛋白糖位点研究。第四章,在糖链和糖肽两个层次解析单抗和复杂糖蛋白的糖型。首先在糖链水平根据GU值成功归属22个N-糖糖型,共有糖型相对比例大于98%,批间一致性良好,其中,G0F相对比例最高,其次是G1F。采用UPLC-MS/MS验证了11个色谱峰,对应11个抗体糖型。然后,采用优化的糖型筛选方法在糖肽水平共检出5种单抗的139种N-糖糖型,其中共有糖型30种,G0F在5种抗体中的相对比例均最高,为最主要糖型,与糖链水平分析结果一致。最后,在糖肽水平分析了复杂糖蛋白药物rhTPO糖型,共鉴定N-糖糖型226种、O-糖糖型75种,其中,主要N-糖糖型共22种、O-糖糖型26种,批间一致性良好。本研究为单抗和复杂糖蛋白药物糖型解析提供了较全面的研究策略。第五章,糖化(Glycation)是化学反应导致的蛋白质糖修饰,与工艺密切相关,一般应避免,国外有少量报道而国内未见报道。本研究建立了从抗体糖化样本收集到超高分辨质谱检测的糖化分析策略。从完整分子和酶解肽段两个层面分析,糖化样本与常规样本相比,己糖指数多1左右,糖化样本以1~2个赖氨酸(K)己糖化修饰为主,轻链第100/150/170位K为轻链主要糖化位点,而重链还存在精氨酸(R)和N-端糖化,重链第325位K、N-端易发生糖化。本研究不仅可以在表征和评价单抗药物的质量方面发挥重要作用,还有助于单抗药物培养工艺、配方和制剂工艺的开发,为单抗药物药效和功能研究提供新思路。第六章,利用阳离子交换色谱(CEX)收集IgG1和IgG2抗体的电荷异构体(酸性组分,主成分,碱性组分),采用超高分辨质谱从完整分子、酶切肽段两个层次分析其电荷异质性来源。对于IgG1,完整含糖分子共检出12种糖型,其中7个糖型在3个组分中均检出且相对比例一致,可排除基础糖型影响,5个差异糖型均含唾液酸,根据SAI分析,糖链末端唾液酸个数越多,唾液酸指数越高,蛋白酸性越大,唾液酸是其电荷异质性的主要来源之一。去N-糖抗体共检出8个质谱峰,N-端Q均发生焦谷氨酸化(PyroQ),因此N-端PyroQ不是电荷异质性的来源,两个酸性组分的糖化比例略大于主成分,但差异不大,糖化可能是电荷异质性来源之一。从酶解肽段层面分析,显示脱酰胺和糖化修饰在酸性组分中略高,可能是酸性组分的来源之一,但不是电荷异质性重要来源之一,氧化和N-端焦谷氨酸化修饰基本无贡献,轻重链主要修饰位点修饰率组分间有微弱差异,它们可能对电荷异质性有微弱影响。对于IgG2,通过切糖前后等电点毛细管电泳比对,证实N-糖修饰不是导致其电荷异质性的重要原因,采用超高分辨质谱分析3个电荷异构体,显示IgG_2-A型二硫键相对比例在Peak3中最高,IgG_2-B型二硫键相对比例在Peak1~Peak3之间呈递减趋势,IgG_2-A/B型二硫键(A/B)相对比例在两种统计方法中略有差别,说明二硫键是导致地诺单抗电荷异构体形成的主要原因。本研究提供了一个较完整的电荷异构体分析方法,为新药筛选和质量控制提供了重要的科学依据。
【图文】：

示意图,内标法,质谱,示意图

图 1.MALDI-TOF 质谱内标法(上)和准内标法(下)示意图a,b:校正值;c:校正后值Fig 1.Schematic diagram of internal(top) and quasi-internal(bottom) calibratioof MALDI-TOF MSa,b:correction value;c:corrected value4800 型 MALDI-TOF 质谱一级谱数据采集使用线型正离子检测模式，加速电 18.2kV，激光能量 6000，质谱信号单次扫描累加 2000 次，，质量扫描范围000~m/z80000。使用 BSA 不同电荷峰校准。数据分析软件为 DE4.5(ABSciex)。超高分辨质谱（Exactive Plus EMR）检测取各抗体切 N-糖前后样本各 20μL，10000g 高速离心 5min，取上清进行 LC

质谱图,内标法,样本

图 2.rhTPO 完整分子的 MALDI-TOF 质谱图a: BSA 校正质谱图;b:校正后质谱图Fig 2.MALDI-TOF MS of intact rhTPOa: mass spectrum after BSA calibration;b: mass spectrum after calibration表 2.rhTPO 切糖前后样本 BSA 准内标法的校正结果比较Tab 2.Comparison of BSA quasi-internal calibration results of rhTPO before and afterglycan removedBtachN-Glycan removedSialic acid of the O-glycanremovedO-Glycan removedAvg.M.W. RSD Error Avg.M.W. RSD Error Avg.M.W. RSD Erro(Da) (%) (%) (Da) (%) (%) (Da) (%) (%)A1 66430.06 0.001 0.0001 66429.18 0.022 0.0012 66431.34 0.011 0.00A2 66430.04 0.004 0.0001 66428.90 0.021 0.0017 66428.57 0.009 0.00A3 66429.94 0.001 0.0001 66429.05 0.040 0.0014 66436.19 0.048 0.00B 66431.92 0.075 0.0029 66426.20 0.051 0.0057 66427.90 0.019 0.00Avg.(Da) 66430.49 66428.33 66429.97
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R917

【参考文献】