铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的分离与活性评价

发布时间：2017-03-27 06:16

  本文关键词：铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的分离与活性评价，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目前,细菌耐药问题日益严重,使传统抗生素面临着失效的危险,直接威胁到人类的生命健康。因此,寻找新的靶点来开发新型抗菌药物具有重要意义。群体感应(Quorum sensing, Q S)是指细菌通过感知菌群中信号分子的浓度变化,从而对周围环境做出自身调整以抵抗不利因素的行为。QS系统调控着致病菌的多种行为如生物被膜的形成及毒力因子的表达。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种常见的机会致病菌,它的耐药性及毒力使得治疗铜绿假单胞菌感染十分困难。P. aeruginosa的群体感应(QS)系统对其致病力及毒力的产生(如绿脓菌素、鼠李糖脂、弹性蛋白酶、swarming运动、生物被膜的形成等)具有重要调控作用。因此,干扰P. aeruginosa QS系统是削弱其毒力的一个发展策略。群体应抑制剂(Quorum sensing inhibitors, QSIs)能够降低P. aeruginosa毒力及致病力,同时不抑制细菌的生长,与传统抗生素相比不会对细菌的生存产生选择性压力,理论上不易产生细菌耐药性,为新型抗感染药物的研究提供了一条新的途径。本实验室在前期工作中发现海洋真菌Aspergillus sp. SY012的发酵产物及中药厚朴的粗提物具有铜绿假单胞菌群体感应抑制活性。本文目的是从Aspergillus sp. SY012的发酵产物及厚朴的粗提物中追踪分离群体感应抑制剂,并对其活性进行评价。利用P. aeruginosa (QSIS-lasI)及P. aeruginosa (PQSI-pqsA)报告菌株追踪检测Aspergillus sp. SY012发酵粗提物的活性,采用硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱层析、HPLC对活性成分进行分离纯化,最终得到两个活性化合物,利用核磁共振波谱解析确定化合物结构分别为α-环匹阿尼酸及其同分异构体异α-环匹阿尼酸。数据分析表明,在亚抑菌浓度下,它们对P. aeruginosa PAOI的弹性蛋白酶活性、绿脓菌素及鼠李糖脂产量、swarming运动等毒力因子都具有显著抑制作用,并且可显著降低las、rhl及pqs系统相关基因转录水平的表达。利用大肠杆菌异源报告菌株E. coli MG4/pKDT 17和E. coli pEAL08-2检测异α-环匹阿尼酸及α-环匹阿尼酸对las和pqs群体感应系统的作用,异α-环匹阿尼酸及α-环匹阿尼酸对于异源表达的las及pqs系统均有显著抑制作用,其中相同浓度的异α-环匹阿尼酸活性强于α-环匹阿尼酸。二者具有相同的平面结构,唯不同就是5位C的立体结构,可能对化合物的QSI活性起到重要作用。利用了P. aeruginosa (QSIS-lasI)报告菌株对中药厚朴的粗提物进行活性追踪及检测,得到明显的活性位点,采用生物自显影薄层色谱、制备薄层色谱和高效液相色谱技术分离到活性化合物,通过核磁共振波谱解析确定活性化合物为和厚朴酚。在亚抑菌浓度下,和厚朴酚能够抑制P. aeruginosa PAOI毒力因子的产生,包括swarming运动、绿脓菌素及鼠李糖脂产量,RT-PCR检测结果表明和厚朴酚对P. aeruginosa PAOI QS相关调控基因的mRNA表达水平有显著抑制作用。和厚朴酚(honokiol)是具有抗氧化,抗炎,抗焦虑,抗抑郁等多种生物活性的多酚,为厚朴的主要成分。和厚朴酚作为P. aeruginosa QSI,是它生物活性的又一新发现。本文从Aspergillus sp.SY012的发酵产物及中药厚朴的粗提物中分离得到了铜绿假单胞菌群体感应抑制剂,并首次发现α-环匹阿尼酸、异α-环匹阿尼酸及和厚朴酚具有QSI活性,为QSI的结构改造和构效关系研究提供良好的前体化合物。本研究具有明确的应用前景和一定的理论意义。
【关键词】：铜绿假单胞菌群体感应抑制剂 Aspergillus sp.SY012 厚朴 α-环匹阿尼酸 异α-环匹阿尼酸 和厚朴酚
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R915
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 0 前言13-31
• 0.1.细菌耐药现状及研究背景13-14
• 0.2. 细菌群体感应系统14-26
• 0.2.1 革兰氏阳性细菌群体感应系统15-16
• 0.2.2 AI-2细菌种间群体感应系统16-17
• 0.2.3 AI-3群体感应系统17-18
• 0.2.4 革兰阴性菌群体感应系统18-26
• 0.2.4.1 铜绿假单胞菌群体感应系统及转录后调控机制20-22
• 0.2.4.2 铜绿假单胞菌的致病机制及感染现状22-23
• 0.2.4.3 铜绿假单胞菌致病机制及主要毒力因子23-26
• 0.3 群体感应抑制因子的研究进展26-29
• 0.3.1 针对QS信号分子合成过程的QSI26
• 0.3.2 针对信号分子结构的QSI26-28
• 0.3.2.1 群体感应淬灭酶27-28
• 0.3.2.2 抗体28
• 0.3.3 针对信号分子受体的群体感应抑制剂28-29
• 0.3.4 以铜绿假单胞菌QS为靶标开发群体感应抑制剂29
• 0.4 本文的研究内容及意义29-31
• 1. Aspergillus sp.SY012的发酵产物中QSI的分离及活性检测31-65
• 1.1 实验材料及仪器31-32
• 1.1.1 实验材料及试剂31
• 1.1.2 实验仪器31-32
• 1.1.3. 模型菌株32
• 1.2 实验方法32-39
• 1.2.1 发酵培养基的配置及灭菌32-33
• 1.2.2 Aspergillus sp.SY012的发酵培养33
• 1.2.3 Aspergillus sp.SY012发酵浸膏的制备33
• 1.2.4 检测Aspergillus sp.SY012发酵产物的群体感应抑制活性33-34
• 1.2.5. Aspergillus sp.SY012发酵粗提物中群体感应抑制剂的分离纯化34-35
• 1.2.6 活性化合物结构鉴定35
• 1.2.7. 检测活性化合物对铜绿假单胞菌PAOI生长的影响及对毒力因子作用35-37
• 1.2.8. 在大肠杆菌中检测活性化合物对las及pqs系统的作用37-38
• 1.2.9. 实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌QS相关基因的mRNA表达水平38-39
• 1.3 实验结果39-62
• 1.3.1 Aspergillus sp.SY012发酵浸膏的制备39
• 1.3.2 初步检测Aspergillus sp.SY012发酵粗提物的群体感应抑制剂活性39-40
• 1.3.3 追踪检测Aspergillus sp.SY012发酵粗提物的群体感应抑制活性40
• 1.3.4 Aspergillus sp.SY012中群体感应抑制剂的活性追踪分离40-53
• 1.3.4.1 G1组分的分离纯化43-48
• 1.3.4.2 G2组分的分离纯化48-53
• 1.3.5 12-1及12-2的结构53-55
• 1.3.6 初步检测α-环匹阿尼酸及异α-环匹阿尼酸的活性55
• 1.3.7 α-环匹阿尼酸及异α-环匹阿尼酸的QSI活性评价55-62
• 1.3.7.1 α -环匹阿尼酸及异α-环匹阿尼酸对P.aeruginosa PAOI生长影响55-56
• 1.3.7.2 α-环匹阿尼酸及异α-环匹阿尼酸对P.aeruginosa PAOI毒力因子的影响56-60
• 1.3.7.3 大肠杆菌异源检测模型检测异α-环匹阿尼酸及α-环匹阿尼酸对las和pqs系统的作用60-61
• 1.3.7.4 异α-环匹阿尼酸及α-环匹阿尼酸对P.aeruginosa PAOI群体感应相关基因表达的影响61-62
• 1.4 讨论62-64
• 小结64-65
• 2 中药厚朴中群体感应抑制剂的分离与活性评价65-72
• 2.1 实验材料、试剂及仪器65
• 2.1.1 实验材料及试剂65
• 2.1.2 实验仪器65
• 2.2 实验方法65-66
• 2.2.1. 中药材处理方法及厚朴粗提物的制备65-66
• 2.2.2. 中药粗提物QSI活性检测66
• 2.2.3. 铜绿假单菌毒力因子检测66
• 2.2.4 铜绿假单胞菌QS相关基因的mRNA检测66
• 2.3 实验结果66-70
• 2.3.1 厚朴中活性成分确定及活性评价66-70
• 2.3.1.1 厚朴中QSI的分离纯化及结构鉴定66-67
• 2.3.1.2 和厚朴酚的QSI活性评价67-70
• 2.4 讨论70-71
• 小结71-72
• 3. 总结与展望72-73
• 3.1 总结72
• 3.2 展望72-73
• 参考文献73-81
• 致谢81-82
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果82

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 林晓 ,陈美云 ,林其昌 ,陈公平;222株铜绿假单胞菌药敏结果[J];现代医药卫生;2002年10期

2 王炳华;王炳云;;106株铜绿假单胞菌药敏结果分析[J];基层医学论坛;2004年06期

3 黄志强;李丽君;卢娟;;肺结核病合并感染铜绿假单胞菌的药敏分析[J];临床肺科杂志;2010年09期

4 封尊玉;;铜绿假单胞菌的治疗策略[J];海南医学;2010年21期

5 刘萍;张志伦;倪丹妮;吴杰红;;铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶因素分析[J];中华医院感染学杂志;2011年23期

6 吴丽娟,熊尔阳,邓光贵;聚合酶链反应检测铜绿假单胞菌的研究现状[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;1996年06期

7 周铁丽,曹建明;一种鉴定铜绿假单胞菌的新方法[J];陕西医学检验;1997年04期

8 朱小平;78株铜绿假单胞菌药敏结果的初步探讨[J];江苏临床医学杂志;1999年05期

9 孙东华,边瑞岩,孙跃军,王庆敏;铜绿假单胞菌污染矿泉水调查分析[J];环境与健康杂志;2000年04期

10 张文英;86株铜绿假单胞菌的耐药调查[J];华夏医学;2000年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 方莉;许媛;黄义山;蔡燕;唐中;杨明辉;廖涛;;铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶基因的检测[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年

2 周明明;周铁丽;李超;吴庆;陈栎江;吴莲凤;彭定辉;;主动外排在铜绿假单胞菌耐药中的作用研究[A];2009年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2009年

3 陈邦;王琰;苟晓峰;陈林;;嘧霉胺对铜绿假单胞菌基因的调节[A];第六届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C];2009年

4 朱丹;李欣;;对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌的体外药敏分析[A];2005年浙江省呼吸系病学术年会论文汇编[C];2005年

5 洪波;贡联兵;;铜绿假单胞菌对亚胺培南的药敏分析[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年

6 徐海茹;田彬;岳娜;胡志东;;临床分离的铜绿假单胞菌耐药结果分析[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年

7 赵书平;姜梅杰;;神经内科重症监护室铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶基因研究[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

8 张杜超;方向群;;微重力对铜绿假单胞菌毒力影响及与肺部感染关系[A];2011年空间生命与生命起源暨航天医学工程学术研讨会论文集[C];2011年

9 李春梅;钟晓祝;;铜绿假单胞菌医院感染监测分析[A];中华预防医学会消毒分会学术年会论文汇编[C];2010年

10 熊娟;梁丽红;;尿液中分离出产红脓素的铜绿假单胞菌[A];2012全国临床微生物与感染免疫学术研讨会论文集[C];2012年

中国重要报纸全文数据库 前5条

1 浙江大学医学院附属第一医院 俞云松;铜绿假单胞菌耐药全国流行[N];健康报;2008年

2 李曙平;铜绿假单胞菌 老年病房的主要致病菌[N];中国中医药报;2003年

3 王振岭;铜绿假单胞菌耐药问题严重[N];中国医药报;2002年

4 天津医科大学总医院检验科 胡志东;关注铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的耐药[N];健康报;2009年

5 ;碳青霉烯类抗生素[N];农村医药报（汉）;2007年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 张瑞琴;氟喹诺酮类药物诱导铜绿假单胞菌耐药性及分子机制的研究[D];山西医科大学;2015年

2 曹振辉;铜绿假单胞菌裂解性噬菌体的筛选、鉴定及应用[D];大连理工大学;2015年

3 苏甜甜;铜绿假单胞菌鞭毛及生物膜调控蛋白FleQ和糖苷水解酶PslG的结构与功能研究[D];山东大学;2015年

4 张明亮;铜绿假单胞菌F_(190-342)-I_(21-83)基因重组鼠伤寒沙门菌的构建及实验免疫研究[D];吉林大学;2015年

5 张若文;烧伤病房耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌耐药机制及分子流行病学研究[D];吉林大学;2012年

6 张亚妮;谷胱甘肽与铜绿假单胞菌致病性及抗生素抗性的关系研究[D];西北大学;2009年

7 陈林;铜绿假单胞菌内在耐药性相关基因的筛选及研究[D];西北大学;2010年

8 李学如;铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的分子机制研究[D];四川大学;2003年

9 徐洋洋;铜绿假单胞菌致病性受信号分子调控及其机理研究[D];西北大学;2013年

10 徐令清;铜绿假单胞菌对微生物的抑制作用及机理探讨[D];华中科技大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 吴苏敏;光动力疗法抗多重耐药铜绿假单胞菌感染的研究[D];中国人民解放军医学院;2015年

2 贾子中;黄连素对烧伤创面铜绿假单胞菌生物膜干预试验及自制中药临床应用观察[D];内蒙古大学;2015年

3 王颖;新型抗耐药革兰氏阴性菌药物的筛选研究[D];北京协和医学院;2015年

4 马超;无机镓化合物抗菌性能研究[D];西南交通大学;2015年

5 李九龙;PA0861在铜绿假单胞菌PAO1中作用的研究[D];宁夏医科大学;2015年

6 梁红梅;铜绿假单胞菌ATCC27853对秀丽隐杆线虫的毒性研究[D];兰州大学;2015年

7 胡凡;铜绿假单胞菌的耐药表型与耐药基因型研究[D];河北农业大学;2015年

8 王国旗;负压创面疗法治疗铜绿假单胞菌感染创面的相关机制研究[D];中国人民解放军医学院;2015年

9 饶慧华;clpP基因在铜绿假单胞菌毒力中的作用[D];福建医科大学;2015年

10 姚远;乳酸钠抑制铜绿假单胞菌的优化建模及其对猪肉持水力和蛋白质的影响[D];上海理工大学;2013年

  本文关键词：铜绿假单胞菌群体感应抑制剂的分离与活性评价，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：270001