单线态氧引发缺氧敏感型聚合物胶束崩解的机理研究

发布时间：2020-06-07 07:03

【摘要】：肿瘤缺氧是实体瘤的关键特征之一,它可为诱发递送纳米药物递送系统的可控释药以增强抗肿瘤疗效。缺氧敏感性纳米疗法主要涉及三类。第一类是用包埋在纳米载体中的前体药物(例如替拉扎明)在缺氧微环境中被激活,从而具有抗肿瘤活性,实现缺氧敏感的肿瘤治疗。第二类是利用偶氮苯作为缺氧敏感性载体的连接分子,常用于构建脂质体、聚合物囊泡或其它类型的纳米载体中。在缺氧的触发下,这些纳米载体会因偶氮基团的断裂而崩解。第三类是基于含有硝基咪唑(2-Nitroimidazole,2-NI)的缺氧敏感纳米载体,该基元可以在缺氧的肿瘤细胞中被还原,还原过程主要涉及的是咪唑环连接的硝基基团,最终生成氨基咪唑以及乙二醛衍生物。在缺氧刺激下,疏水性的硝基咪唑在细胞内相关酶的作用下转变为亲水性的氨基咪唑,进而引发纳米载体的崩解和药物的释放。通常的做法是将硝基咪唑与不同的材料共价相连,常用的材料包括壳聚糖、羧甲基葡聚糖、烷基化聚乙烯亚胺、可离子化脂质和两亲性肽聚合物。这些硝基咪唑修饰的(大)分子可以自组装形成各类缺氧敏感的纳米载体。根据相关文献报导,肿瘤组织内部的缺氧程度是不均匀的(即缺氧异质性)。氧气的含量在很大程度上决定了硝基咪唑修饰的纳米载体的释药速率和程度,因此缺氧异质性会影响缺氧敏感型纳米载体的递送效率,导致抗肿瘤疗效降低。为解决这一问题,研究者们开发了一种光诱导型纳米系统,它可以诱导形成缺氧微环境或通过增加氧气消耗来加剧缺氧的程度。这些纳米制剂常选择运用光敏剂(例如二氢卟吩e6,Chlorin e6,Ce6)或类似的结构单元(例如二噻吩-苯并三唑)以实现该功能。即使在氧含量正常或缺氧程度较低的情况下,光敏剂可以在激光的照射下把周围的氧气转变成单线态氧从而维持一定的低氧环境来促进纳米载体的分解,进而实现药物的应答释放并快速达到细胞内最低有效药物浓度。然而,我们猜想在该体系中引入的单线态氧可能与硝基咪唑发生化学相互作用。据本课题组的前期研究发现,单线态氧可以将疏水性的咪唑转化为亲水性的尿素并导致聚合物-咪唑共轭胶束的崩解。由于各咪唑化合物是单线态氧的优良猝灭剂,我们推测硝基咪唑也可能通过咪唑氧化途径与单线态氧发生反应。因此带有硝基咪唑的纳米载体可能是缺氧和单线态氧-双重响应,这将有利于克服肿瘤部位缺氧异质性导致药物释放速率及胞内药物浓度的巨大差异。因此,本课题的目的是研究体外单线态氧和带有硝基咪唑的胶束之间的相互作用机理。有别于之前侧重缺氧敏感纳米胶束的应用性研究,我们目前的工作是试图阐明单线态氧氧化硝基咪唑的机理,是一项基础研究。为了实现这一目的,我们将硝基咪唑与两亲性甲氧基聚(乙二醇)-聚(天冬氨酸)(mPEG-PAsp)共聚物的侧链共价结合,最终制备出的共聚物可在水溶液中自组装成胶束。将光敏剂Ce6物理包载于胶束内,用于产生单线态氧的模型药物。另外,使用包载相同光敏剂的甲氧基聚(乙二醇)-聚(β-苄基-L-天冬氨酸)(mPEG-PBLA)胶束(CM)作为实验的负对照。为了将硝基咪唑部分共价连接到mPEG-PAsp共聚物的侧链,我们合成了含有氨基的硝基咪唑衍生物(NI-NH_2)。通过核磁共振氢谱,核磁共振碳谱和质谱分析证实了NI-NH_2的成功合成。mPEG-PBLA共聚物是通过聚乙二醇与天冬氨酸N-羧酸酐单体(BLA-NCA)的开环聚合合成的,其结构经核磁共振氢谱和红外光谱法确认。mPEG-PBLA的平均分子量为7,220 Da,疏水链段的重复数为约10。在碱性条件下苄基去保护后得到mPEG-PAsp,之后NI通过酰胺化反应与聚合物主链的聚天冬氨酸共价结合最终获得的嵌段共聚物mPEG-PAsp-NI(分子量7,820 Da)。高分子聚合物mPEG-PAsp-NI与小分子NI表现出类似紫外-可见吸收光谱,这间接证明了NI与高分子主链的成功连接。响应型胶束(Responsive micelle,RM)的临界胶束浓度为12.0±0.3μg/mL,这与具有相同聚合物主链的咪唑聚合物胶束非常相近。在给药后,具有较低CMC的胶束由于稳定性高,因而具有较长的体内循环时间。Ce6在胶束中的负载量分别为3.7±0.3%w/w(mPEG-PAsp-NI)和1.0±0.1%w/w(mPEG-PBLA)。响应型胶束的药物负载能力与非响应型胶束(Control micelle,CM)的负载能力一致。由于存在载体与药物之间的氢键相互作用,我们推测RM具有优于对照胶束CM的载药能力。与咪唑类似,NI也是一种有效的氢键受体。由于Ce6包含多个氢供体(例如-COOH),氢键的形成可以增强载体和药物之间的相互作用,导致胶束内的Ce6载药量增加。我们测得的胶束载药量与文献报导的纳米粒子的载药量(5%)相一致。在包载Ce6之后,胶束的半径有略微的增加,这是由于药物的存在占据了胶束内核中心的一部分空间而引起尺寸扩大。和空白RM相比,RM/Ce6的表面电荷绝对值显著增大。我们推断有相当多的Ce6积累在了胶束的疏水核心和亲水壳界面上。尽管Ce6的Log P(4.6)值很大,但它的结构中也含有三个羧基(pKa=4.0)。这些羧基在中性条件下的电离会增强Ce6的亲水性及其向核-壳界面的转移。在离子化之后,羧基会转化为带负电的离子形式形式,最终导致胶束表面电荷的改变。基于单线态氧诱导的从疏水咪唑到亲水性尿素转化的反应,我们提出了NI与单线态氧反应后生成草酰醛和硝基甲酰胺的反应机理。质谱MS分析证实了反应中间产物和最终产物的存在,这直接证明了该机理的正确性。通过醛基特异性的荧光分析,我们进一步证实了草酰醛的形成。经过波长为660 nm的激光照射后,Ce6产生的单线态氧可将硝基咪唑氧化为草酰醛,其可与2,2'-呋喃甲醛反应产生荧光二氟乙基咪唑,反应产物可以在355 nm处检测到其荧光吸收。当没有激光照射(即没有单线态氧产生)时,没有发现二氟乙基咪唑的荧光吸收。这一实验结果的显著荧光对比也从侧面支持了我们假设的机理。之后我们通过核磁共振氢谱进一步分析单线态氧和硝基咪唑之间的反应。在光照的条件下,对于小分子(NI)和含有NI的聚合物共轭物,NI的特征质子峰的积分面积随着Ce6浓度(即单线态氧浓度)的增加而持续下降。然而,在该实验条件下,基于核磁共振氢谱分析,NI-醛转化的最大程度为65%。尽管这NI氧化与咪唑氧化都必须首先形成内过氧化物氧化产物,但硝基部分的存在可能阻碍内过氧化物键的分解并阻止内过氧化物进一步转变为其他中间体和最终产物。咪唑内过氧化物环中有两个氢,而NI内过氧化物中只有一个氢;由于体内过氧化物的分解依赖于碱对NI中氢的攻击,所以硝基的存在将碱攻击的几率降低到50%,从而导致了从NI到醛的相对不完全转化。尽管如此,所有上述数据都说明了疏水性NI可以转化为亲水性草氨醛,即NI的单线态氧响应性。应用激光照射引发Ce6产生单线态氧,包载Ce6的单线态氧响应胶束(RM/Ce6)的水力学直径随着光照时间或单线态氧浓度的增加而增加;在无光照条件下,RM/Ce6的水力学粒径保持不变。在光照的时间范围内(50分钟),没有出现粒径曲线的平台期。这间接表明NI在实验条件下未被完全氧化。透射电子显微镜的粒径分析与水力学粒径相一致。用激光照射50分钟(660 nm,100mW/cm ~2)后,从透射电子显微镜图片中可以看出,RM胶束从112±17 nm(多分散指数/PDI:0.15)增大至401±72 nm(PDI:0.18)。胶束的大小通常是由聚合物链长度、微结构和两亲性的相互作用决定的。含有NI的聚合物胶束的尺寸增大原因是由于单线态氧诱导的疏水性NI转变为亲水性草酰醛。这种转换导致聚合物分子两亲性的改变以及胶束的崩解。从粒度的变化趋势来看,光敏剂Ce6在50分钟的激光照射后产生大量的单线态氧,因此引起显著的胶束膨胀。不过,由于在反应终产物中存在多个供氢体和受体,理论上能够形成三维氢键网络,因此未观察到胶束的彻底崩解。这与在含有咪唑的胶束的单线态氧引起的尺寸扩大中观察到的现象类似。由于粒径增长,水分子更容易扩散到胶束中从而促进药物的释放。因此,在有无光照的情况下可以观察到显著的药物释放差异。本课题还利用小鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)进行细胞毒性实验来间接证明单线态氧诱导的硝基咪唑-醛转化。选择游离Ce6(阳性对照),非响应性mPEG-PBLA胶束(CM/Ce6,阴性对照)和响应性胶束(RM/Ce6)的三个样品。用三种不同的照射条件(1分钟,5分钟,10分钟)对以上样品进行处理。无论照射时间长短,细胞毒性的强弱均如下:Ce6RM/Ce6CM/Ce6。由于没有释放屏障,游离的Ce6表现出最高的细胞毒性,即最低的半数致死浓度。在激光照射后,胶束的疏水内核中Ce6产生单线态氧与NI反应,诱导胶束分解并释放药物(Ce6)。与之形成鲜明对比的是,非响应性对照胶束的药物释放仅可通过简单扩散,药物释放速率显著慢于RM组。因此,CM/Ce6样品显示出到更高的细胞活力(即低毒性)。由于单线态氧是细胞毒性的来源,因此在没有激光照射的情况下,所有样品均没有检测出毒性。作为另一种阴性对照,没有光敏剂的非响应性胶束在有无光照的情况下都没有表现出细胞毒性。细胞毒性实验的结果表明,随着照射持续时间的增长,纳米载药胶束可以产生时间依赖性的细胞毒性。综上所述,本课题揭示了单线态氧和硝基咪唑相互作用机理,主要终产物为草酰醛。基于这种机制,具有缺氧敏感性的硝基咪唑聚合物胶束还具有单线态氧敏感特性,并且通过光照诱导的硝基咪唑-醛转化引起胶束的快速分解从而促进药物释放。单线态氧响应性胶束的崩解可以在激光照射后触发光敏剂的快速释放,因此可以很好地解决单线态半衰期短和扩散距离有限的问题。这种发现可通过触发按需药物释放,从而克服大多数实体瘤治疗中缺氧异质性导致的药物释放不均一、不可控问题,进而增强体内抗癌功效。本课题构建的缺氧/单线态氧双敏感纳米胶束给药系统还可用于共递送细胞毒性药物与光敏剂实现化疗与光动力学疗法的协同作用。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943

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