【摘要】：目的:(1)EGCG衍生物Y6体内对人肝癌血管生成的影响及机制研究。(2)EGCG衍生物Y6体内增效减毒柔红霉素抗肝癌作用及机制研究。方法:建立人HepG2裸鼠移植瘤模型,随机分为8个组(n=8,雌雄各半),分别为对照组(0.5%羧甲基纤维素钠)、EGCG(40mg/kg)组、Y6-M(55 mg/kg)组、DNR(2mg/kg)组、DNR(2mg/kg)+Y6-H(110mg/kg)组、DNR(2mg/kg)+Y6-M(55mg/kg)组、DNR(2mg/kg)+Y6-L(27.5 mg/kg)组和DNR+EGCG组,EGCG和Y6每天灌胃给药,DNR每四天腹腔注射给药,20d后处死裸鼠,取瘤称重。第一部分实验方法:用内皮细胞特异性标记物CD34标记血管内皮细胞计算瘤组织血管密度(MVD);RT-PCR检测瘤组织中VEGF mRNA的表达;免疫组织化学法和Western blotting检测瘤组织中VEGF蛋白的表达。第二部分实验方法:⑴称瘤重,计算抑瘤率,HE染色观察瘤组织形态结的构变化,TUNEL染色计算瘤组织凋亡细胞数;⑵HE染色观察心肌形态结的构变化,测定心肌中SOD活力及MDA的含量;⑶RT-PCR检测瘤组织中CBR1 mRNA的表达,免疫组织化学法和Western blotting检测瘤组织CBR1蛋白的表达,高效液相色谱法(HPLC)检测血清中柔红霉素的代谢产物柔红霉素醇的浓度。第三部分实验法:RT-PCR检测瘤组织中HIF-1αmRNA的表达,免疫组织化学法检测瘤组织中HIF-1α蛋白的表达,Westernblotting检测HIF-1α及MAPK/ERK和PI3K/AKT信号转导通路中ERK1/2/p-ERK1/2和AKT/p-AKT蛋白的表达。结果:第一部分EGCG衍生物Y6单用或联合柔红霉素对人肝癌血管生成的抑制作用(1)瘤组织血管密度:与对照组相比,EGCG、Y6和DNR单用均能显著抑制瘤组织血管的生成(P0.05);与DNR组相比,各联合给药组的瘤组织的MVD显著减少(P0.01);Y6-M单用或联合DNR组瘤组织的MVD均显著低于EGCG单用或联合DNR(P0.05或P0.01)。Y6对移植瘤组织MVD的抑制作用呈剂量依赖性。(2)瘤组织VEGF mRNA的表达:与对照组相比,EGCG、Y6-M和DNR单用均能显著抑制瘤组织VEGF mRNA的表达(P0.05或P0.01);与DNR组相比,Y6或EGCG联合DNR显著减少VEGF mRNA的表达;Y6-M单独或联合DNR分别与EGCG单独或联合DNR相比,瘤组织VEGF mRNA的表达差异无统计学意义;Y6对瘤组织VEGF mRNA表达的抑制作用具有剂量依赖性。(3)瘤组织VEGF蛋白的表达:与对照组相比,Y6-M组和DNR组瘤组织中VEGF蛋白的表达显著下降(P0.05或P0.01);与DNR组相比,EGCG或Y6联合DNR显著下调瘤组织中VEGF蛋白的表达(P0.05或P0.01);分别与EGCG单独或联合DNR相比,Y6-M单独或联合DNR瘤组织中VEGF蛋白的表达量显著减少(P0.05或P0.01);Y6对瘤组织VEGF蛋白表达的抑制作用具有剂量依赖性。第二部分EGCG衍生物Y6体内增效减毒蒽环类抗生素抗肝癌作用的研究1、Y6单用或联合柔红霉素对裸鼠肝癌细胞移植瘤生长的抑制作用(1)抑瘤率:EGCG、Y6单用对移植瘤生长的抑制作用并不是很强,但均可增强DNR对移植瘤的抑制作用;经金正均法计算,Y6-M联合DNR的q1.15,两者联用具有协同作用;Y6-M或Y6-H联合DNR的抑瘤率显著大于EGCG联合DNR,并呈剂量依赖性。(2)瘤组织病理检查:瘤组织细胞异型明显,核浆比例增加,核大深染。EGCG或Y6联合DNR组瘤组织坏死程度均较单独给药组增加;随着Y6剂量的增加瘤组织坏死面积增加。(3)TUNEL染色的结果:瘤组织凋亡细胞经TUNEL染色,核深染呈棕黄色。与对照组相比,EGCG组、Y6-M组及DNR组瘤组织凋亡细胞数显著增加(P0.05或P0.01);与DNR组相比,各联合给药组瘤组织凋亡细胞数显著增加(P0.01);Y6单用或联合DNR组促进瘤组织细胞凋亡的作用均显著强于EGCG单用或联合DNR(P0.05或P0.01),并具有剂量依赖性。2、EGCG衍生物Y6对柔红霉素所致裸鼠心肌毒性损伤的保护作用(1)心肌组织HE染色结果:与对照组对比,EGCG组和Y6-M组心肌细胞排列整齐,细胞间隙正常无水肿,对裸鼠心肌基本无毒性作;DNR组裸鼠心肌纤维排列紊乱,细胞轮廓模糊不清,细胞间隙变窄;EGCG与Y6对DNR所致裸鼠心肌组织损伤均有保护作用。(2)心肌SOD活力和MDA含量的检测:与对照组相比,DNR组心肌SOD活性显著下降(P0.01),同时MDA含量显著增加(P0.01);与DNR组相比,各联合给药组心肌组织均较DNR组SOD活力显著增加(P0.01),MDA含量显著减少(P0.01),Y6对DNR所致心脏毒性的保护作用强于EGCG,并呈剂量依赖性。3、EGCG衍生物Y6减少瘤组织CBR1的表达及柔红霉素醇的生成(1)瘤组织CBR1 mRNA的表达:与对照相比,EGCG组及Y6-M组瘤组织CBR1 mRNA的表达显著降低(P0.05或P0.01);与DNR组相比,各联合给药组瘤组织CBR1 mRNA的表达显著降低(P0.01);Y6对瘤组织CBR1 mRNA表达的抑制作用呈剂量依赖性。(2)瘤组织CBR1蛋白的表达:与对照组相比,Y6-M组瘤组织CBR1蛋白的表达显著降低(P0.05);与DNR组相比,EGCG或Y6联合DNR组瘤组织CBR1蛋白的表达量显著减少(P0.01)。(3)HPLC检测柔红霉素醇的浓度:EGCG和Y6均可减少柔红霉素醇的生成,Y6对DNR代谢抑制作用比EGCG强;随着Y6剂量的增加血清中柔红霉素醇浓度减少。第三部分Y6单用或联合柔红霉素通过MAPK/ERK和PI3K/AKT信号转导通路对瘤组织中HIF-1α表达的影响。(1)瘤组织HIF-1α的表达:Y6单用对瘤组织HIF-1α基因及蛋白表达的抑制作用显著强于EGCG;EGCG或Y6-M联合DNR对瘤组织HIF-1α基因表达的抑制作用差异无统计学意义(P0.05),Y6-M联合DNR对瘤组织HIF-1α蛋白的表达显著强于EGCG联合DNR(P0.01),Y6对HIF-1α基因及蛋白表达的抑制作用具有剂量依赖性。(2)ERK1/2/p-ERK1/2和AKT/p-AKT蛋白表达:Y6或DNR单用均显著抑制瘤组织p-ERK1/2和p-AKT蛋白的表达(P0.05或P0.01),Y6的作用强于EGCG。EGCG或Y6均可增强DNR对瘤组织p-ERK1/2和p-AKT蛋白表达的抑制作用;Y6对瘤组织p-ERK1/2和p-AKT蛋白表达的抑制作用具有剂量依赖性。结论:1、EGCG衍生物Y6体内抑制人肝癌移植瘤血管的生成。2、EGCG衍生物Y6体内增效减毒蒽环类抗生素抗肝癌作用。3、EGCG衍生物Y6体内抑制血管生成和增效减毒蒽环类抗生素抗肝癌作用可能与其抑制MAPK/ERK和PI3K/AKT信号转导通路下调HIF-1α、CBR1及VEGF的表达有关。
【图文】：
在光学显微镜下呈现棕褐色，可以观察到血管内皮细胞有呈褐色颗粒状、形成管腔或闭合的条索状分布，如图 1-1 所示。各组裸鼠移植瘤组织的 MVD 统计如表 1-3、图 1-2 所示，与对照组瘤组织相比，EGCG组、Y6-M 组及 DNR 组的 MVD 均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）；说明 EGCG 或 Y6 单用对瘤组织微血管生成有抑制作用；与 DNR 组相比，，各联合组的 MVD 显著减少（P<0.01），并且 Y6 联合 DNR 各组的 MVD随着 Y6 剂量的增加而减少，说明 Y6 对 DNR 抑制裸鼠移植瘤微血管生成具有增效作用并呈剂量依赖性。Y6-M 组的 MVD 为（37.27±2.07）显著低于 EGCE 组（43.38±2.68），与 DNR+EGCG 组相比较，DNR+Y6-M 组 MVD显著降低（P<0.05）。说明 Y6 单用或联合 DNR 用药对瘤组织微血管生成的抑制作用比 EGCG 强。
6 体内抑制血管生成和增效减毒柔红霉素抗肝癌作用及其机制研究 2018表 1-3 各组肿瘤组织的平均血管密度（x s，n=8）Tab1-3 Average vascular density of tumor tissues in each group (x s, n=组别 平均血管密度（个/视野）对照组 52.00±5.03EGCG 组 43.38±2.68△△Y6-M 组 37.27±2.07△△##DNR 组 31.47±2.29△△DNR+Y6-H 组 10.60±1.28**DNR+Y6-M 组 14.87±1.35**#DNR+Y6-L 组 24.73±1.53**DNR+EGCG 组 18.93±1.26**相比较，△P㩳0.05 或△△P㩳0.01；与 DNR 组相比较，*P㩳0.05 或**P㩳较，#P㩳0.05 或##P㩳0.01
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965
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本文编号：2701535
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